ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА
Метод розеткообразования для определения
Т- и В-лимфоцитов в периферической крови.
Основные направления и методические принципы. Учение о клеточной кооперации в осуществлении иммунологической адаптации, иммунологического надзора за генетическим постоянством внутренней среды организма получило значительное развитие за два десятилетия своего существования. Выделение тимусзависимой (Т) и тимуснезависимой (В) клеточных систем в конце 60 х годов позволило изучить их функции и взаимодействие и детализировать эффекторное звено в реализации иммунного ответа, определив субпопуляции Т лимфоцитов: супрессоры, хелперы, киллеры, клетки антителозависимой цитотоксичности, отличающиеся друг от друга специфическими рецепторами, по которым они и могут быть детерминированы в общем пуле лимфоцитов. Были выявлены специфические различия В клеток по мембранным иммуноглобулинам, рецепторам к Fc фрагменту иммуноглобулина G, к С3 компоненту комплемента.
Значительно шире современные оценки фагоцитоза в комплексном анализе генетически детерминированных дефектов иммунитета: распознавание антигенов макрофагами и представление их Т лимфоцитам.
Существенное значение в понимании роли клеточных реакций в формировании клинических синдромов приобретает все углубляющееся изучение сывороточных факторов: лимфокинов, монокинов, костномозгового стимулятора антителопродуцентов и др.
Т-лимфоциты
Метод розеткообразования для определения Т и В лимфоцитов в периферической крови.
Принцип. Поверхностные рецепторы, специфичные для различных субпопуляций лимфоцитов, проявляются, связывая эритроциты, нативные или нагруженные антителами к этим рецепторам. Эритроциты образуют с поверхностью лимфоцита фигуру розетки. За розетку принимают лимфоцит, присоединивший 3-5 эритроцитов. В ряде случаев эритроциты плотно окутывают лимфоцит, образуя так называемую морулу. Интерпретация этого феномена крайне разноречива. Нередко он отражает методические неточности постановки. Феномен розеткообразования может быть усилен путем обработки эритроцитов нейраминидазой.
Определение Т-лимфоцитов методом
спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана
(Е-РОК).
Принцип.
Тимусзависимые Т лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые выступают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (Е-РОК: Erythrocyte -розеткообразующие клетки).
Приборы и оборудование.
1. Центрифуга ЦЛК 1.
2. Холодильник (бытовой).
3. Термостат.
4. Микроскоп люминесцентный (МЛ 2 или другие типы).
5. Камера Горяева.
6. Счетчик клеток.
7. Автоматические пипетки или микропипетки.
8. Пробирки силиконированные или пластиковые.
9. Штатив для пробирок.
Реактивы.
1. Среда 199, раствор Хенкса.
2. Гепарин (готовят раствор из расчета 25 ЕД/мл крови).
3. Фосфатный буфер рН 7,4.
4. 0,01 % раствор акридинового оранжевого.
5. 0,1 % раствор эозина, 0,1 % раствор трипанового синего на дистиллированной воде.
6. Гипак (изопак, верографин, уротраст).
7. Фиколл 400 (полисахарид с молекулярной массой 400000).
8. Эритроциты барана.
Ход определения.
10 мл крови из локтевой вены вносят в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь раз водят фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1 : 2; 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 частей 9 % фиколла и 5 частей 33,9 % гипака плотности 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин.
В связи с тем что могут использоваться разные системы центрифуг, необходимо применять такие режимы центрифугирования, чтобы сила разделения в интерфазе составила 400 g. Вели чину центробежного ускорения G вычисляют по формуле: G=l,l*n2 R* 10-5 (n-число оборотов в минуту, R-радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл гипака с разделяемой суспензией в см).
После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и дважды отмывают буферным раствором. Концентрацию клеток доводят до 2-4 млн. в 1 мл в среде 199, содержащей 10 % раствор телячьей сыворотки или сыворотки IV (АВ) группы крови человека. При использовании последней необходима инактивация при 56 °С в течение 30 мин и абсорбция эритроцитами. Для этого 0,5 мл осадка отмытых эритроцитов добавляют к 1 мл сыворотки и инкубируют в течение 1 ч при 37 °С, периодически встряхивая. Желательна абсорбция сыворотки пулом лейкоцитов, учитывая возможность наличия антилейкоцитарных антител. При использовании человеческой сыворотки необходимо учитывать влияние аутоцитолимфотоксинов, проявляющих максимум активности при 4 °С.
1 Можно использовать любой буферный раствор рН 7,0-7,2 без ионов Са++ (наличие ионов Са++ способствует конгломерации клеток, их коагуляции).
Перед использованием суспензии лимфоцитов проверяют их жизнеспособность. Равные объемы 0,1 % раствора водного эозина на среде Хенкса или Рингера двойной концентрации без глюкозы и 0,1 % раствора трипанового синего на дистиллированной воде смешивают перед употреблением и 1-2 капли добавляют к каплесуспензии клеток и часть смеси переносят в камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При правильной обработке процент мертвых клеток не нревышает 3.
Приготовление эритроцитов барана.
Используют эритроциты одного животного или смесь, полученную от нескольких. Эритроциты можно хранить в течение 2 нед при 4 °С в растворе Олсвера (глюкоза -2,05 г, цитрат натрия - 0,8 г, хлорид натрия - 0,42 г, дистиллированная вода-100 мл), рН этого раствора устанавливают равным 6,1 с помощью 10 % раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты барана 3-4 раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5 % (по объему) взвесь клеток.
Подготовка и учет реакции розеткообразования. Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г.
В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5 % взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50:1. Инкубируют смесь в термостате 37 °С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК 1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 °С. Подсчет клеток мы рекомендуем проводить в камере Горяева. Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом с оследующим приготовлением мазков и просчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать стекла и анализировать результаты реакций в другой, свободной от постановки или менее загруженный, день. Однако глутаровый альдегид изменяет поверхность эритроцитов барана, вызывает неспецифическое прилипание их к клеткам крови человека. Не исключено, что глутаровый альдегид десеквестрирует скрытые антигены в мембране бараньих эритроцитов, к которым имеются рецепторы у лимфоцитов человека. Более перспективен в этом плане ацетальдегид, фиксация которым эритроцитов стандартизирует определение Т лимфоцитов и делает возможным обоснованное сопоставление результатов, полученных разными лабораториями.
Для просчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника про бирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01 % раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2-3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру счета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами.
В день взятия крови на Т лимфоциты необходимо проводить общий анализ крови, который дает возможность высчитывать абсолютные значения Т клеток.
Нормальные величины Т клеток, определенные нами у 150 здоровых доноров: 54,3±0,98 %; 979,8±16,8 кл/мкл.
Определение активных Т-лимфоцитов,
образующих розетки с эритроцитами барана
(ЕА-РОК).
Все подготовительные операции выполняют так, как это описано для Е-РОК, за исключением сыворотки, которую при определении ЕА-РОК не добавляют в инкубационную среду, и длительной холодовой инкубации. После термостатирования 10 мин при 37 °С и последующего центрифугирования при 1000 об/мин (для ЦЛК 1) в течение 5 мин проводили подсчет Т активных лимфоцитов способом, описанным выше для общих Т клеток.
Содержание Т активных лимфоцитов у 150 здоровых доноров составило: 34,6 ±1,92 %, 840+123 кл/мл.
Определение теофиллинчувствительности Т клеток.
Принцип.
Препараты, повышающие уровень внутриклеточного цАМФ (теофиллин, аденозин), ингибируют реакцию спонтанного розеткообразования между зрелыми Т лимфоцитами и эритроцитами барана.
Ход определения.
Используемые реактивы и оборудование аналогичны для описанного выше метода определения Т активных лимфоцитов. Исключение составляет теофиллин (химически чистое соединение), 0,3 М раствор которого на дистиллированной воде, подогретой до 60 °С, готовят каждый раз при постановке метода. Охлажденный до комнатной температуры теофиллин добавляют в инкубационную среду (без добавления сыворотки), термостатируют, центрифугируют и просчитывают клетки так же, как и Т активные. Выявляют 2 субпопуляции: теофиллинчувствительные Т клетки, т.е. лимфоциты, утратившие способность к розеткообразованию под влиянием обработки теофиллином, и теофиллинустойчивые Т клетки. У здоровых доноров соотношение теофиллин чувствительных и устойчивых Т клеток составляет 1:3.
Выявление Т лимфоцитов, образующих розетки с аллогенными и аутологичными эритроцитами.
Принцип.
Существуют субпопуляции лимфоцитов, образующих розетки с аллогенными и аутологичными эритроцитами.
Приборы, оборудование и реактивы описаны выше. Суспензию лимфоцитов выделяют уже описанным выше методом.
Эритроциты человека: необходимо использовать эритроциты 0(1) резус-отрицательной группы крови. Следует брать, по возможности, кровь нескольких постоянных доноров. Приготовление эритроцитов аналогично описанному методу для эритроцитов барана. К взвеси лимфоцитов в тех же соотношениях добавляют одно временно эритроциты барана и эритроциты человека. Просчитывают лимфоциты, связавшие эритроциты и барана, и человека. Реакцию с аутологичными эритроцитами проводят так же, как с аллогенными.
В-лимфоциты
Определение В-клеток методом розеткообразования
с эритроцитами барана в системе ЕАС.
Принцип.
Тимуснезависимые В лимфоциты имеют на своей мембране специфические детерминанты, позволяющие дифференцировать их от Т лимфоцитов. Таким детерминантом является поверхностный (мембранный) иммуноглобулин класса М. Число лимфоцитов, несущих иммуно глобулин A, G, Е или D, крайне незначительно (А-1-5%,D и Е-2-4%),рецепторы для Fc фрагмента иммуноглобулина G для третьего компонента комплемента (Сз). Выделяют и другие специфические рецепторы, в частности для вируса Эпштейна-Барр, плазмоклеточный антиген, антиген 1а. Однако последние не нашли еще отражения в клинической практике. Чаще применяется метод выявления В клеток по их способности образовывать розетки с бараньими эритроцитами, нагруженными антителами в среде комплемента. Такие эритроциты маркируют и Fc, и Сз рецепторы В лимфоцитов.
Приборы и реактивы те же, что и для метода определения Т лимфоцитов. Аналогично готовят и суспензию лимфоцитов. Антисыворотку, содержащую антитела к эритроцитам, готовят путем иммунизации кролика эритроцитами барана или быка. Кролику в краевую вену уха вводят 3-5 мл 50 % суспензии эритроцитов. На 4-6 й день у него берут кровь и получают сыворотку, которая в этот период на высоте иммунного ответа преимущественно содержит антитела класса М. Наилучший эффект получают при работе с гамма глобулиновой фракцией сыворотки, которую получают высаливанием в насыщенном растворе аммиака или риванола. Антисыворотку инактивируют и определяют ее гемолитический и агглютинационный титр.
Можно использовать готовую и широко доступную кроличью гемолитическую сыворотку.
Комплемент. Источником комплемента служат свежие сыворотки мышей. Беспородных мышей декапитируют, кровь сливают в пробирку, получают сыворотку, которую затем сорбируют пулом человеческих эритроцитов и определяют активность комплемента в гемолитической системе.
Сенсибилизация эритроцитов.
Смешивают равные объемы 1 % взвеси бараньих эритроцитов (предпочтительнее эритроциты бы
ка) и антисыворотки к виду эритроцитов, используемых в реакции (или кроличьей гемолитической сыворотки) в субагглютинирующем разведении. Смесь инкубируют 40 мин при 37 °С, осторожно встряхивая каждые 10 мин. После термостатирования эритроциты трижды отмывают фосфатным буфером до 10 мин при 1500 об/мин. Супернатант отбрасывают, а к осадку добавляют первоначальный объем фосфатного буфера и равный объем абсорбированной мышиной сыворотки, содержащей комплемент в разведении 1 : 10. Смесь помещают в термостат при 37 °С на 30 мин. Вновь эритроциты трижды отмывают. При отмывании их центрифугируют осторожно при 1000 об/мин 5 мин, чтобы не вызвать агглютинации эритроцитов. Готовят 0,5 % суспензию эритроцитов и просматривают под микроскопом. При наличии агглютинации эритроцитов суспензия непригодна. Готовые эритроциты, нагруженные антителами и комплементом (ЕАС), можно хранить в холодильнике (4 °С) 4-5 дней.
Определение ЕАС лимфоцитов.
К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов. Оптимальное соотношение эритроцитов к лимфоцитам равно 20 : 1. Смесь инкубируют 45 мин при 37 °С, после чего пробирки помещают в лед. Подсчет В клеток проводят описанным выше способом (см. «Определение Т клеток»).
| 
