Окраска по Май-Грюнвальду

Фиксатор-краситель эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду

Назначение

Фиксатор-краситель по Май-Грюнвальду в растворе, далее по тексту - фиксатор-краситель, предназначен для применения в качестве фиксатора и красителя форменных элементов крови.

Состав

Фиксатор-краситель представляет собой 0,30% раствор сухого красителя эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду в метаноле.

Подготовка к анализу

Приготовление нейтрализованной воды

Взвесить на аналитических весах с точностью ± 0,01 г 9,50 г натрия фосфорнокислого двузамещенного безводного или 22,70 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного; навеску перенести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довести до 1000 мл дистиллированной водой и тщательно перемешать (раствор 1).

Взвесить на аналитических весах с точностью ± 0,01 г 9,07 г калия фосфорнокислого однозамещенного; навеску внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довести до 1000 мл дистиллированной водой и тщательно перемешать (раствор 2).

Внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл 63 мл раствора 1 и 37 мл раствора 2, довести до 1000 мл дистиллированной водой и определить рН полученной нейтрализованной воды на рН-метре; рН должен находиться в диапазоне 6,8 - 7,2.

Полученную нейтрализованную воду можно хранить при комнатной температуре (+18 - 25°С).

Приготовление мазков крови

Мазки крови сделать на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла следующим образом.

Взять предметное стекло за длинные края и прикоснуться его поверхностью, отступив на 0,5 - 1 см от узкого края, к капле крови (но не к коже). Предметное стекло следует держать на столе или в левой руке за края. Правой рукой приставить шлифованное стекло узким краем к предметному стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвинуть его вправо до соприкосновения с каплей крови. Выждать до тех пор, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением провести его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на предметном стекле, не доходя 1 - 1,5 см до его края. Сильно нажимать на стекло нельзя, так как многие клетки крови могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается “метелочкой”.

После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска; при медленном высыхании может изменяться морфология клеток. Уложить препараты мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.

Проведение определения

1 способ

Непосредственно перед определением приготовить рабочий раствор красителя азур-эозин по Романовскому: смешать раствор красителя с нейтрализованной водой в соотношении 1:10 - 1:20 и профильтровать. Полученный рабочий раствор красителя можно хранить в течение 6 часов.

На нефиксированные мазки крови налить неразбавленный раствор фиксатора-красителя так, чтобы он покрыл весь мазок. Через 3 мин. смыть фиксатор-краситель нейтрализованной водой и далее красить рабочим раствором красителя азур-эозин по Романовскому в течение 15 - 45 мин. По истечении этого времени препараты промыть нейтрализованной водой, высушить на воздухе и микроскопировать.              

2 способ

Непосредственно перед определением разбавить фиксатор-краситель нейтрализованной водой в соотношении 1:2 - 1:5. Полученный разбавленный раствор фиксатора-красителя можно хранить в течение 6 часов.

На нефиксированные мазки крови налить неразбавленный раствор фиксатора-красителя так, чтобы он покрыл весь мазок. Через 3 мин. смыть фиксатор-краситель нейтрализованной водой и далее красить разбавленным раствором фиксатора-красителя в течение 5 - 15 мин. По истечении этого времени препараты промыть нейтрализованной водой, высушить на воздухе и микроскопировать.  

Окраска форменных элементов крови должна быть следующей:

ЗАМЕЧАНИЯ:

1. Вместо фиксатора Май – Грюнвальда можно использовать фиксаторы Лейшмана и Йеннера. Они отличаются только по способу приготовления, а результат окраски тот же самый.

2. Можно сделать рабочий раствор на фосфатном буфере с рН 6.8-7.0. Результаты будут стабильными.

4. Количества растворов азура и эозина в рабочем растворе нуждаются в корректировке, это становится понятным после просмотра первых срезов. Особенно это необходимо при использовании несертифицированных красителей (без C.I. и сертификата BSC).

5. Вместо рабочего раствора азура и эозина можно пользоваться коммерческим раствором краски Романовского. Перед использованием в рутине оттестировать разведение, рН и время окрашивания.

6. При появлении мелких синих хлопьев азура в растворе он не пригоден для окраски. Сделать свежий раствор. Посуда для всех красителей в цитологии должна быть безупречно чистой. После отмывки осадков старых растворов посуда промывается дистиллированной водой и высушивается досуха. В ней не должно быть никаких остатков моющих средств.

7. Однажды приготовленный рабочий раствор годен в течение 1 или 2 рабочих дней независимо от количества партий, которые проходят в течение дня.

8. Дистиллированная вода для промывки должна иметь рН не ниже 6. При хранении дистиллированная вода закисляется. Если есть возможность, для промывки использовать фосфатный буфер с рН 6.8-7.0. Или любой другой буфер с аналогичной рН.

ССЫЛКИ: Ромейс (1953), Лилли (1962).