Окраска по Романовскому
Азур-эозин по Романовскому
Принцип.
Окрашивание различных элементов клеток в разные цвета и оттенки смесью основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок.
Меры предосторожности:
Потенциальный риск применения набора – класс 2б.
При работе с набором необходимо соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).
При работе с биологическими жидкостями следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как исследуемый материал является потенциально инфицированным, способным длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.
Все использованные материалы дезинфицировать в соответствии с требованиями МУ-287-113.
Посуда и аппаратура.
•секундомер;
•микроскоп;
•рН-метр;
•цилиндры мерные вместимостью 25 -1000 мл;
•стекла предметные;
•бумага фильтровальная;
•перчатки резиновые;
•калий фосфорнокислый однозамещенный;
•натрий фосфорнокислый двузамещенный;
•вода дистиллированная.
•Градуированная пипетка.
•Штатив для мазков.
•Кювета со стеклянным мостиком для окраски.
Приготовление забуференной воды:
Взвесить на аналитических весах с точностью ±0,01 г 9,50 г натрия фосфорнокислого двузамещенного
безводного или 22,70 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного; навеску перенести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довести до 1000 мл дистиллированной водой и тщате льно перемешать (раствор 1).
Взвесить на аналитических весах с точностью ±0,01 г 9,07 г калия фосфорнокислого однозамещенного; навеску внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довестидо 1000 мл дистиллированной водой и тщательно перемешать (раствор 2).
Внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл 63 мл раствора 1 и 37 мл раствора 2, довести до 1000 мл дистиллированной водой и определить рН полученной
забуференнойводы на рН-метре; рН должен находиться в диапазоне 6,8 - 7,2. Полученную забуференную воду можно хранить при комнатной температуре (+18/+25°С).
Реактивы.
В продаже имеется готовый раствор краски Романовского, а также сухая краска Романовского (Гимзы), из которой приготовляют раствор следующим образом: 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта (последний хуже).
Раствор оставляют на 3—5 сут, часто взбалтывая для лучшего растворения краски.
Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3—5 сут, периодически взбалтывая. Приготовленная таким образом краска хорошо сохраняется длительное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей.
Вновь полученный или приготовленный раствор красителя Романовского перед употреблением оттитровывают, т. е. окрашивают несколько фиксированных мазков крови в течение 25—40 мин различно разведенной краской (1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). По хорошо окрашенному препарату устанавливают нужное количество капель краски на 1 мл воды и время окрашивания.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
(методика окраски): Мазки необходимо зафиксировать фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду или типа Лейшмана в течение 2-3 минут. Непосредственно
перед окраской приготовить рабочий раствор: смешать краситель с забуференной водой в соотношении 1:20 - 1:45 и профильтровать.
Полученный рабочий раствор красителя можно использовать в течение 6 ч асов.
Зафиксированные мазки крови поместить в рабочий раствор красителя, по истечении 20-45 мин препараты промыть проточной водой 1-2 сек, высушить на воздухе и микроскопировать.
РЕЗУЛЬТАТ ОКРАСКИ:
Окраска форменных элементов крови должна быть следующей:
эритроциты - розовые, розовые с серым или бежевым оттенком, бежево-коричневые;
тромбоциты - розово-фиолетовые или фиолетовые;
ядра лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов - фиолетовые;
цитоплазма лимфоцитов - голубая, серо-голубая или сине-голубая;
цитоплазма моноцитов- серо-голубая;
цитоплазма нейтрофилов - бледно-розовая или розово-серая;
зернистость нейтрофилов - фиолетовая или красно-фиолетовая;
зернистость эозинофилов- оранжево-красная, розово-красная или розово-фиолетовая;
зернистость базофилов- фиолетовая
Окраска по Романовскому в модификации Филипсона.
Принцип.
Применение красителей-фиксаторов, которыми мазки крови в первый период одновременно фиксируются и частично окрашиваются, а во второй период, после разбавления красителей -фиксаторов дистиллированной водой, докрашиваются окончательно.
Посуда и аппаратура — см. «Окраска по Романовскому».
Реактивы.
1.Одну часть готовой краски Романовского и 3 части этилового спирта (ректификата) тщательно смешивают. Краска сразу же пригодна к употреблению, но можно готовить ее и заранее.
2. Дистиллированная вода нейтральной реакции.
Методика.
Приготовленный краситель наливают на нефиксированный мазок, покрывая его полностью и
через 1 — 1мин30 сек, не сливая красителя, прибавляют к нему но каплям примерно столько же дистиллированной воды, следя за тем, чтобы вода при соединении с красителем не сливалась с мазка. Через 20—30 мин краситель смывают водой и мазок высушивают.
Этим способом клетки окрашиваются хорошо, но иногда, по-видимому, от недоброкачественности спирта в эритроцитах обнаруживаются мелкие пузырьки, мешающие определению степени насыщения их гемоглобином.
Способы быстрой окраски мазков краской Романовского по Алексееву.
Принцип.
Одновременная фиксация и окраска мазков с применением для ускорения окрашивания по первому способу подогрева дистиллированной воды и по второму способу — подогрева разведенной краски Романовского.
Посуда и аппаратура.
1. Глазные пипетки.
2. Водяная баня.
3. Темная бутыль с притертой пробкой емкостью 1 л. Остальное — см. «Окраска по Романовскому».
Реактивы.
1. Разведенная краска Романовского (1,5 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).
2. Краситель Лейшмана для второго метода (растворяют 4 г сухой краски в 1 л метилового спирта и хранят в темной посуде).
3. Чистый метиловый спирт.
4. Нейтральная дистиллированная вода.
5. Фильтровальная бумага.
Методика.
1. На сухой нефиксированный мазок наносят глазной пипеткой 6—10 капель краски Романовского, распределяя ее той же пипеткой равномерным слоем. Через 30 с другой пипеткой добавляют к краске по каплям удвоенное количество подогретой до 50—60° дистиллированной воды. Покачиванием препарата перемешивают краску с водой и оставляют на 3 мин в покое, затем смывают ее дистиллированной водой и высушивают мазок фильтровальной бумагой. При этом методе окраски частично гемолизируются эритроциты, однако клетки белой крови не изменяются.
При втором способе, приводимом ниже, результаты получаются лучшей окраска препаратов мало отличается от обычной окраски по Романовскому.
2. На сукой нефиксированный мазок наливают равномерным слоем 10—12 капель краски Лейшмана. Через 20—30 с, не сливая краску, добавляют к ней нагретый до 50—60° раствор краски Романовского в количестве, способном удержаться на препарате. Через 3 мин, не сливая краску, смывают ее сильной струей дистиллированной воды и высушивают препарат фильтровальной бумагой.
| 
