Исследование морфологии эритроцитов
Морфологию эритроцитов можно исследовать в световом микроскопе в нативных препаратах и в окрашенных мазках крови. В клинической практике морфологию эритроцитов обычно исследуют в окрашенных мазках крови.
Приготовление мазков крови унифицированным методом (1979).
Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые предварительно моют и обезжиривают.
Подготовка стекол.
Реактивы. 1. Хозяйственное мыло —2 % раствор или раствор стирального порошка: 20 г растворить в 975 мд воды и добавить 20 мл пергидроля.
2. Смесь Никифорова: равные части этилового спирта 96% и диэтилового эфира.
Специальное оборудование не требуется.
Ход обработки стекол.
Стекла (новые и бывшие в употреблении) помещают в эмалированную посуду в 2 % раствор хозяйственного мыла или стирального порошка на 8—10 ч. Кипятят в указанном растворе 5—10 мин, старые мазки предварительно стирают ветошью или ватным тампоном. Более длительное кипячение или использование алюминиевой посуды не рекомендуют, так как стекла мутнеют. Промывают в проточной воде. Насухо вытирают и помешают в смесь Никифорова на 30-60 мин. Насухо вытирают чистым полотенцем и хранят в широкогорлой чистой посуде с притертой пробкой. Чистые стекла рекомендуется брать либо пинцетом, либо за края (соприкосновение пальцев с поверхностью стекла оставляет жирные следы).
Техника приготовления мазков.
На сухое подготовленное описанным выше способом предметное стекло наносят мазок крови следующим образом. На стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места укола пальца) небольшую каплю крови. Оставляют стекло в горизонтальном положении и размазывают каплю крови по стеклу с помощью чистого шлифованного стекла, помещая его под углом 45°; коротким ребром, подождав, пока вся кровь расплывется по нему, быстро проводят по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом травмируются форменные элементы крови.
Мазки высушивают на воздухе и маркируют (лучше простым карандашом). Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины (располагаться на 1—1,5 см от краев, занимать почти всю длину стекла) и оканчиваться «метелочкой» Толстые (густо-розового цвета) мазки не следует использовать, так как в них морфология клеток плохо различима.
Фиксация и окраска мазков унифицированным методом (1979).
В качестве унифицированных приняты методы окраски по Нохту и Паппенгейму.
Реактивы для фиксации: метиловый спирт х. ч. или раствор эозинметиленового синего по Маю-Грюнвальду.
Реактивы для окраски мазков по Нохту.
1. Основной раствор азура II: 1 г краски растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Оставляют в посуде из темного стекла на 12—14 дней при комнатной температуре, после чего используют.
2. Основной раствор эозина калия: 1 г краски растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Оставляют в посуде из темного стекла при комнатной температуре на 12 14 дней, затем используют.
3. Фосфатный буфер (смесь Бейзе) pH 7,4—7,5: смешивают 0,49 г калия фосфата однозамешенного безводного (КН2Р04) и 0,09 г натрия фосфата двузамещенного безводного. (Na2HP04 и дистиллированной воды 1000 мл.
4. Рабочий раствор азур-эозина: перед употреблением смешивают 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина калия и 55 мл буферного раствора (пропорции красителей могут варьировать, их устанавливают опытным путем при приготовлении свежих партий основных растворов).
Реактивы для окраски мазков по Паппенгейму.
1. Раствор эозин-метиле-нового синего по Маю - Грюнвальду. При отсутствии готового раствора красителя его можно приготовить, растворив 1 г сухого красителя в 1000 мл метилового спирта. Раствор готов к употреблению через 4 дня.
2. Рабочий раствор азур-эозина по Нохту.
Специальное оборудование.
Кювета для фиксации и окраски мазков со штативом-контейнером (при отсутствии используют эмалированные лотки с установленными для стекол «рельсами» из пары стеклянных палочек, соединенных резиновыми трубками).
Фиксация мазков.
Фиксатор мазков наливают либо в кювету, либо в широкогорлую посуду с притертой пробкой. Высушенные на воздухе мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с фиксатором (или кладут по одному в посуду) на 5—10 мин. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы (или вынимают пинцетом стекла и устанавливают в штативе), оставляют на воздухе до полного высыхания.
Окраска по Нохту.
Высохшие фиксированные мазки, не вынимая из контейнера, помещают в кювету с рабочим раствором краски на строго определенное время, подобранное для каждой партии красителя (от 20 до 45 мин). При отсутствии кюветы с контейнером стекла помещают горизонтально на «рельсы» (мазком кверху) и наливают высокий слой (3—4 мл на мазок) рабочего раствора краски. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы с красителем и помешают его в кювету с водопроводной водой (при отсутствии кюветы краску со стекол смывают, не снимая их с «рельсов», водопроводной водой). Высушивают мазки на воздухе.
Окраска по Паппенгейму.
Сухие нефиксированные мазки помещают в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3—5 мин (или наливают на мазок, помещенный на «рельсы» высоким слоем). Контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой (или на мазок, помещенный на «рельсы», не сливая краситель, добавляют дистиллированную воду на 1 мин). Помещают контейнер с мазками в кювету с азур-эозиновой краской по Нохту (или наливают на мазок краску) на 8 15 мин.
Смывают краску водопроводной водой.
Мазки высушивают на воздухе.
Окраска по Романовскому— Гимзе производится так же, как и по Нохту; в качестве красителя используют готовый раствор Романовского Гимзы, который перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой новой партии красителя (25—40 мин).
Исследование морфологии эритроцитов.
Принцип.
Исследование окрашенных мазков крови с помощью иммерсионной системы микроскопа..
Специальное оборудование.
Микроскоп.
Реактивы.1. Иммерсионное масло. 2.Диэтиловый эфир.
Ход исследования.
Предметное стекло с окрашенным, высохшим на воздухе мазком крови помещают на столик микроскопа и с помощью малого увеличения (окуляр 10Х, объектив 10Х) находят край мазка. Не меняя положения стекла, наносят каплю иммерсионного масла на край мазка на место, расположенное под объективом. Переводят иммерсионный объектив в положение, вертикальное к мазку, при этом объектив погружается в каплю масла.
Осторожно слегка вращают макровинт до появления изображения в поле зрения микроскопа. Затем с помощью микровинта устанавливают четкую видимость препарата (критерием правильно подобранного для каждого глаза фокусного расстояния будет ясное изображение клеток с четкими границами и внутриклеточной структурой). После установки микроскопа приступают к исследованию морфологии эритроцитов, обращая внимание на форму, размеры клеток, интенсивность их окраски, наличие внутриклеточных включений и пр. Поскольку клетки имеют определенный объем, для лучшего их рассмотрения надо постоянно менять фокусное расстояние с помощью микровинта.
Для получения полного представления о морфологии эритроцитов необходимо просмотреть несколько полей зрения, передвигая мазок либо рукой, либо с помощью крестообразного устройства. Рассматривать морфологию эритроцитов надо только в гонких местах мазка, где эритроциты расположены одиночно, не образуют «монетных столбиков».
По окончании микроскопии с помощью макровиита поднимают тубус микроскопа, снимают стекло с предметного стекла, стирают масло с иммерсионного объектива н предметного стекла марлей, смоченной эфиром( или ксилолом).
У здоровых людей эритроциты имеют примерно одинаковый размер. Для более точного представления о размере клеток проводят эритроцитометрию— измерение диаметра эритроцитов (см. 3.3.3). Эритроцит имеет форму двояковогнутого диска. В окрашенных препаратах эритроциты круглой формы, розового цвета. Ок-сифилия клетки обусловлена присутствием гемоглобина, поэтому по интенсивности окраски можно судить о степени насыщенности эритроцитов гемоглобином. Эритроциты здоровых людей имеют равномерную окраску и небольшое просветление в центре (нормохромня).
Клиническое значение. Изменения морфологии эритроцитов в виде появления эритроцитов разного размера (анизоцитоз), разной формы (пойкшгоцитоз), разной окраски (анизохромия) являются важными морфологическими симптомами различных форм анемии.
Наиболее часто наблюдается бледная окраска эритроцитов с более широкой неокрашенной центральной частью — гипохромии эритроцитов, которая обусловлена низким насыщением эритроцита гемоглобином и характерна для распространенных форм малокровия, связанных с дефицитом железа (постгеморрагические анемии, анемии беременных, при опухолях, сепсисе и других тяжелых инфекционных заболеваниях, заболеваниях желудочно-кишечного тракта и пр.). При этом гипохромия, как правило, сочетается с уменьшением размера эритроцитов —микроцитозом (табл.).
Гипохромия эритроцитов сопутствует и более редким формам малокровия, не связанным с дефицитом железа; свинцовому отравлению, талассемпи и другим наследственным повреждениям эритроцитов. Следует иметь в виду, что гипохромия эритроцитов может наблюдаться не только при снижении концентрации гемоглобина и числа эритроцитов в крови, но и при нормальных количественных показателях. Реже встречается усиленная окраска эритроцитов гиперхромия. связанная с повышенным насыщением эритроцитов гемоглобином и сочетающаяся с увеличенным их размером — макроцитозом, мегалоцитозом. Эта изменения эритроцитов характерны для дефицита таких факторов кроветворения, как витамин В12, фолиевая кислота, и наблюдаются при анемии Аддисона — Бирмера, дифиллоботриозе, органических заболеваниях желудка, кишечника, алкоголизме, беременности и др.
Изменение окраски в виде полихраматофилии (эритроциты сероватого цвета) обусловлено окраской кислыми и основными красителями. В норме встречаются единичные полихроматофильные эритроциты. Их число повышается при усиленном эритропоэзе (постгеморрагические анемии, гемолитические анемии и др.).
При талассемни и других формах малокровия встречаются так называемые мышевидные эритроциты с окрашенным участком в центре клетки на фоне неокрашенной зоны.
Появление базофшьной пунктации в эритроцитах связано с патологическим кроветворением и характерно для свинцового отравления, но встречается при других формах анемии. Эритроциты с ядром — нормобласты, эритробласты встречаются в мазках крови при различных анемиях. Большое количество нормобластов характерно для гемолитических анемий, метастазов опухоли в костный мозг. Гигантские ядерные эритроциты - мегалобласты — свидетельствуют о патологическом кроветворении, связанном с дефицитом витамина В12, фолиевой кислоты. При этих же состояниях наблюдаются и эритроциты с остатками ядер — кольца Кебота, тельца Жолли. Последние формы постоянно обнаруживают в мазках крови у больных после удаления - селезенки.
Шаровидная форма эритроцитов, отличающаяся уменьшенным диаметром и интенсивной, без просветлений окраской, микросфероцитоз - является патогномичным морфологическим признаком гемолитической анемии — наследственного микросфероцитоза (см. табл.).
В небольшом количестве микросфероциты могут встречаться и при других гемолитических анемиях.
Большое диагностическое значение имеет обнаружение в мазках крови эритроцитов серповидной формы. Этот симптом характерен для серповидноклеточной анемии, относящейся к группе наследственных гемоглобинопатий (S-re- моглобиноз).
В сомнительных случаях, когда число серповидных эритроцитов в мазках невелико, следует проводить пробы на серповидность эритроцитов, основанные на использовании веществ (метабисульфит натрия, янусовый зеленый, метиленовый синий), понижающих содержание кислорода в препаратах.
На стекле смешивают каплю крови и каплю одного из указанных веществ, накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом через 10—15 мин, затем 24—48 ч. В положительных случаях в препаратах количество эритроцитов серповидной формы увеличивается.
Литература.
Циркина А. С. В кн.; Справочник по клиническим лабораторным методамисследования/ Под ред. Е. А. Кост. 2-е изд. М.: Медицина, 1975, с. 17.
| 
