Методы исследования фагоцитоза in vitro
Метод Кост и Стенко.
Принцип.
Использование способности лейкоцитов поглощать и переваривать микробы для оценки их функциональной активности.
Посуда и аппаратура.
1. Агглютинационные (видалевские) пробирки.
2. Химические пробирки с диаметром и цветом стекла, идентичными бактериологическим стандартам.
3. Капилляр от аппарата Панченкова.
4. Пипетка.
5. Бактериальные стандарты, соответствующие концентрации 1—2 или 4 млрд. микробных тел в 1 мл.
6. Термостат.
Вся посуда должна быть стерильна.!!
Реактивы
1. 4% нейтральный цитрат натрия (стерильный).
2. Физиологический раствор (стерильный).
3. Взвеси живых или убитых микробов.
Для приготовления взвеси живых микробов в пробирку или чашку Петри с однодневной культурой микробов наливают небольшое количество физиологического раствора, перемешивают и разведенную культуру микробов пипеткой переносят в химическую пробирку.
Разбавляя в дальнейшем физиологическим раствором, доводят содержимое пробирки до степени мутности бактериального стандарта с концентрацией 1 или 2 млрд. микробных тел. в 1 мл.
Убитые культуры обычно продаются в запаянных ампулах с этикетками, на которых указана степень разведения. Для изменения концентрации физиологический раствор добавляют точно по расчету.
Методика.
В видалевскую пробирку набирают одним и тем же капилляром от аппарата Панченкова:
1 капилляр 4% раствора цитрата натрия, 2 капилляра крови,
1 капилляр однодневной живой культуры с 1—2 млрд. микробных тел в 1 мл или убитых микробов с концентрацией 4 млрд. тел в 1 мл.
Тщательно перемешивают и ставят в термостат при 37° на 1 ч (в течение этого времени термостат открывать нельзя). Затем содержимое пробирки тщательно перемешивают, делают на предметных стеклах очень тонкие мазки, высушивают их на воздухе, фиксируют и красят обычными методами. В окрашенных мазках сосчитывают 100 нейтрофилов.
Счет производят по краю мазка с иммерсионной системой (окуляр 10Х или 15Х). Отмечают процент фагоцитирующих нейтрофилов — показатель фагоцитарной активности и среднее количество микробов в каждом из фагоцитировавших нейтрофилов — фагоцитарный индекс.
Для более точной оценки показателей фагоцитоза определяют количество фагоцитированных микробов в 1 мкл крови.
Для этого нужно в тот же день дополнительно взять кровь для определения количества
лейкоцитов в 1 мкл крови и для подсчета лейкоцитарной формулы.
Пример.
Процент фагоцитирующих нейтрофилов 20,
среднее число микробов на фагоцитирующий нейтрофил 10,
количество лейкоцитов в 1 мкл крови 10 000,
процент нейтрофилов в крови 60.
При этих условиях количество нейтрофилов в 1 мкл крови будет:
(10000*60):100 = 6000,
а количество фагоцитирующих нейтрофилов
(6000*20):100= 1200
Следовательно, в 1 мкл крови было фагоцитировано 1200*10=12 000 микробов.
Для оценки переваривающей активности клеток фагоцитированные микробы при подсчете общего их количества распределяют по интенсивности окрашивания на три группы:
1) интенсивно окрашенные — непереваренные;
2) слабо окрашенные, измененные микробы — частично переваренные и
3) почти полностью разрушенные — переваренные.
Источники ошибок.
1. Загрязнение культуры;
перед каждым исследованием следует проверять культуру бактериоскопическим методом.
2. Употребление нестерильных, несвежих реактивов-раствора натрия и физиологического раствора.
3. Употребление кислого раствора цитрата натрия вместо нейтрального.
Клиническое значение.
По степени фагоцитоза можно судить о функциональном состоянии нейтрофилов, а также о реактивности организма.
| 
