Цитохимическое определения пероксидазы в лейкоцитах.
Пероксидазная реакция (определение активности миелопероксидазы К.Ф. 1.11.1.7) используется для выявления миелоидных клеточных элементов. Вместе с ШИК-реакцией и реакцией на неспецифическую эстеразу, миелопероксидаза является одним из основных цитохимических методов для дифференциальной диагностики острых лейкозов.
Принцип реакции:
Пероксидаза является ферментом - лизосомальной каталазой, катализирующей в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. При окислении ортотолидина или бензидина, используемых в реакциях, образуются интенсивно окрашенные соединения, в том случае, если в клетке присутствует пероксидаза, при взаимодействии с которой перекись водорода разрушается с выделением кислорода, который и окисляет орто-толидин или бензидин, переводя их в окрашенные соединения.
Реагенты:
1.Бензидин
Реактив на пероксидазу: бензидин (на кончике ножа) растворяют в 6 мл 96 % спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл З % перекиси водорода. Реактив годен к употреблению в течение 5—6 дней
2.Перекись водорода 3%.
3.Краситель по Романовскому..
4.Фиксирующая смесь (10% спиртовой раствор формалина).Приготовление фиксатора (10% спиртовой раствор формалина): 1мл 40% формалина смешивают с 9 мл 96° этилового спирта. Как прозрачный, так и мутный молокообразный раствор формалина одинаково пригоден. Полученный 10% раствор формалина хранится в холодильнике.
5. Дистиллированная вода;
6. 96° этиловый спирт.
Оборудование.
1. Секундомер.
2. Стекла предметные.
3. Рельсы или емкости для окраски мазков;
4. Пипетки
5. Пробирки хим.;
6. Бумага фильтровальная;
7. Цилиндры мерные вместимостью 25-500мл.
8. Перчатки резиновые
Подготовка к анализу.
Приготовление мазков крови и костного мозга:
2-3 мазка крови (или костного мозга) сделать на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла следующим образом.
На сухое предметное стекло, ближе к короткой стороне наносят пипеткой небольшую каплю крови. Предметное стекло следует держать на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставить шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом менее 45° и продвинуть его вправо до соприкосновения с каплей крови. Выждать до тех пор, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением провести его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1 - 1,5 см до его края. Нельзя сильно нажимать на стекло, так как многие клетки крови могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается “метелочкой”.
После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток крови
Приготовление препаратов костного мозга аналогично приготовлению препаратов периферической крови.
Приготовление рабочего раствора:
Растворить содержимое одного флакона бензидина ( орто-толидина ), в 3мл 96?этилового спирта и долить 2мл дистиллированной воды. Хорошо взболтать и перед употреблением добавить пипеткой 1 каплю 3% перекиси водорода.
Ход реакции:
Сухие мазки крови или к /мозга фиксировать в 10% спирт - формалиновой смеси
| не более 15секунд!
| Промыть проточной водой
| 10сек.
| Стекла с мазками крови или костного мозга поместить на рельсы и на них налить свежеприготовленный рабочий раствор с только что добавленной в него 3 %H2O2 перекисью водорода
Примечание: при наличии достаточного количества мазков окраску можно производить в емкости Хеллендахела (8 препаратов) или Коплина (5 препаратов).
При этом необходимо приготовить рабочий раствор в количестве, достаточном для заполнения емкости.
| Оставить на 15- 20мин при комнатной температуре.
| Промыть дистиллированной водой и промокнуть фильтровальной бумагой
| 10сек.
| Докрасить 0,5% раствором красителя по Романовскому
| 15-20мин.
| Промыть стекла в проточной воде
| 10сек
|
Примечание:
Цитохимические исследования проводят в мазках крови, костного мозга, лейкоконцентрата, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфоузлов, селезенки, лейкозных инфильтратах разной локализации.
Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов.
При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.
Приготовленные мазки не рекомендуется хранить более 24часов, т. к. активность большинства внутриклеточных ферментов снижается.
Нефиксированные мазки могут храниться в темноте в течение 3 недель.
Результаты окраски:
Нормальные величины:
В крови здоровых людей 3- 16% нейтрофилов окрашены резко положительно, 60-90%- положительно, остальные – слабо положительно. СЦК нейтрофилов здоровых людей равен 2,56±0,033.
Изменения при патологических состояниях
Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов. При острых миелобластных лейкозах активность фермента в бластах варьирует от умеренной до выраженной, при острых монобластных- слабая, при острых лимфобластных – отрицательная.
Цитохимическое исследование миелопероксидазы
Миелопероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по мере созревания клеток. В сегментоядерных нейтрофилах здоровых людей выявляется высокая активность миелопероксидазы в виде гранул, заполняющих цитоплазму.
Самая высокая активность фермента наблюдается в зрелых эозинофилах. В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность миелопероксидазы, как правило, высокая. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки, активность фермента снижается. Зрелые базофилы могут быть почти отрицательными по данному признаку. Слабоположительная реакция на миелопероксидазу наблюдается в различном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах и мегакариоцитах миелопероксидаза не определяется.
В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема–Кнолля или его модификаций.
Метод Грэхема-Кнолля
Принцип метода: В присутствии миелопероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин.
Посуда
* Химические стаканы.
* Мерные цилиндры.
* Пипетки.
Реактивы:
* 4% формалиново-спиртовой раствор (10 частей 40% формалина и 90 частей 96% спирта).
* Пероксидазный реактив: бензидин (на кончике ножа) растворяют в 6 мл 96% спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл 3% перекиси водорода. Реактив годен к употреблению в течение 5 — 6 дней.
* Краситель Романовского-Гимзы.
Ход окраски:
* Свежие мазки (1-2-дневной давности) фиксируют 4% формалиново-спиртовым раствором в течение 30 секунд.
* Обмывают в проточной воде и высушивают.
* Заливают пероксидазным реактивом на 5 минут.
* Тщательно промывают в проточной воде и высушивают.
* Докрашивают красителем Романовского-Гимзы.
* Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул.
Модифицированный метод Нарциссова Р. П.
Принцип:
В присутствии пероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин. Для уменьшения инактивации фермента использованы соответствующий фиксатор и небольшое количество перекиси водорода.
Реактивы
* 60% водный раствор ацетона.
* 0,1 M раствор бората натрия (можно использовать фосфатный или мединаловый буферный раствор pH 7,6).
* Инкубационная среда: 5 мл 5% водного раствора трилона Б, 10 мл раствора бората натрия, 35 мл насыщенного раствора бензидина и 2 мл 0,003% раствора перекиси водорода (готовят из 3% раствора разведением в два этапа перед употреблением).
* 0,5% раствор метилового зеленого на буферном растворе (pH 5,0) или 0,1% водный раствор метиленового синего.
Ход окраски
* Свежеприготовленные мазки фиксируют в 60% водном растворе ацетона в течение 30 секунд.
* Промывают дистиллированной водой.
* Инкубируют в инкубационной среде в течение 1 часа в термостате при 37 °C.
* Промывают дистиллированной водой.
* Докрашивают мазки метиловым зеленым или метиленовым синим в течение 10 минут.
Модифицированный метод Шафран М. Г. и соавторов
Принцип:
окисление О-дианизидина перекисью водорода в присутствии миелопероксидазы.
Реактивы
* 10% спиртовой раствор формалина (1 мл 10% формалина и 9 мл этилового спирта).
* Спиртовой раствор О-дианизидина:
24 мг О-дианизидина растворяют в 5 мл метанола и доводят дистиллированной водой до 9,9 мл.
* 3% раствор перекиси водорода.
* Реакционная смесь: к спиртовому раствору О-дианизидина прибавляют перед употреблением 0,1 мл перекиси водорода.
* 0,25% водный раствор азура А или другой ядерный краситель.
Ход окраски
* Мазки фиксируют спиртовым раствором формалина в течение 10 - 15 секунд.
* Споласкивают проточной водой.
* На мазки наносят реакционную смесь на 2 — 3 мин при комнатной температуре.
* Споласкивают проточной водой.
* Докрашивают раствором азура в течение 10 — 15 секунд.
* Споласкивают проточной водой и высушивают.
Нормальные величины активности миелопероксидазы
В крови здоровых людей 3 — 16% нейтрофилов имеют резко положительную, 60 — 90% - умеренно положительную, остальные — слабо положительную реакцию на миелопероксидазу. СЦК нейтрофилов здоровых людей равен 2,23 — 2,89. У детей в возрасте 7 лет СЦК составляет 2,03 — 2,11, к периоду полового созревания увеличивается у мальчиков до 2,163 — 2,237, а у девочек уменьшается до 1,949 — 2,011, к 15 годам половые различия выравниваются.
Клиническое значение активности миелопероксидазы
Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов. При острых миелобластных лейкозах активность миелопероксидазы в опухолевых клетках варьирует от слабой до выраженной в зависимости от степени дифференцировки бластов. Так, при остром миелобластном лейкозе с низкой степенью дифференцировки бластов (M1 по ФАБ-классификации), количество пероксидазоположительных бластов невелико (не превышает 10%), степень активности фермента в них невысокая. Тогда как при остром промиелоцитарном лейкозе (M3 по ФАБ-классификации) миелопероксидаза выявляется практически в 100% бластных клеток, причем активность ее равнозначна таковой в зрелых нейтрофилах. Однако отсутствие точных количественных способов оценки цитохимических реакций не позволяет использовать их для верификации степени дифференцировки бластных клеток, а следовательно, и более тонкой дифференциальной диагностики острых лейкозов. Таким образом, с помощью цитохимических реакций определяют линейную направленность, а не степень дифференцировки бластов.
При острых монобластных лейкозах реакция на миелопероксидазу в опухолевых клетках слабая, при острых лимфобластных лейкозах — отрицательная.
Снижение активности фермента в нейтрофилах обнаружено при инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях. У больных хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,44 — 1,82.
| 
