Цитохимическое выявление гликогена по методу Шабадаша
Локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток.
При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS- или ШИК-реакцию (по названию реактивом шифф -йодная кислота).
Метод Щабадаша.
Принцип.
Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота).
В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание.
Реактивы.
1. 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг периодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
2. 1 н. НСl соляной кислоты: 82,5 мл концентрированной НСI отн. плотности 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л.
3. Реактив Шабадаша. К 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди (CuNO3), 0.9 г нитрата кальция [Ca(NO3)2] и 10 мл формалина
4. Метабисульфит калия.
5. Реактив Шиффа
6. Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. НСI. Готовят перед употреблением.
7. 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).
Специальное оборудование.
Горелки.
Термостат.
Весы.
Ход определения.
Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в рктиве Шабадаша в течение 30 мин. 2.
Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1-2 мин).
Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30—40 мин (в темноте).
Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10—20 с.
Промывают в дистиллированной воде.
Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.
Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК - положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др.
Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.
Цитохимическое исследование гликогена
Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов - шифф-йодная кислота).
Метод Шабадаша
Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.
Посуда и оборудование
* Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.
* Мерные цилиндры.
* Градуированные пипетки.
* Колбы емкостью 250 мл.
* Воронки.
* Горелки.
* Термостат.
* Весы.
Реактивы
* 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
* Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).
* Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.
* Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.
* 1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).
* 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).
Ход окраски
* Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.
* Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
* Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
* Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
* Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 - 2 мин).
* Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 - 40 мин (в темноте).
* Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
* Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
* Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.
* Промывают в дистиллированной воде.
Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.
В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.
Результат метода Шабадаша
Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.
Расчет количества гликогена производят по полуколичественному методу или выражают в процентах.
Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.
Проба со слюной.
Препарат помещают в свежесобранную слюну и оставляют на 30 мин в термостате. Затем производят окраску на гликоген приведенным выше методом. Инкубация препаратов со слюной способствует расщеплению гликогена, и при реакции с реактивом Шиффа не получается розовой окраски.
Идентифицировать гликоген можно также путем предварительной инкубации мазков с амилазой (1 мл профильтрованной амилазы растворить в 40 мл физиологического раствора) в течение 30 мин в термостате.
На практике проба со слюной обычно не проводится, поэтому под PAS-положительным материалом понимаются, как правило, все полисахариды, а не только гликоген.
Нормальные величины метода Шабадаша
В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.
Концентрация ШИК(PAS)-положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты, миелоциты). В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. У здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов крови (+++) колеблется в пределах 2—12 %, средней интенсивности окраски (++) - в пределах 72—90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК равен 1,71—2,04. Некоторые авторы приводят более высокие значения СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей (2,485 - 2,555). У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена (1,93 - 2,03).
В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал располагается следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.
В моноцитах гликоген чаще выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне светло-розового диффузного окрашивания.
В лимфоцитах крови здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 8,1 - 12,7% клеток. Некоторые авторы дают цифры от 2 до 30%.
В норме от 3 до 10% клеток эритроидного ряда содержат мукополисахариды.
В мегакариоцитах костного мозга гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30—50), напоминая скопления кровяных пластинок. У здоровых людей число гликогенположительных мегакариоцитов составляет 58,45 - 65,55 %. В тромбоцитах PAS-положительный материал выявляется в виде мелких рассеянных гранул по периферии клетки либо в виде интенсивного центрально расположенного пятна.
Клиническое значение метода Шабадаша
Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, эритремии, сахарном диабете, уменьшение - при агранулоцитозах, лучевой болезни, хроническом миелолейкозе, особенно при прогрессировании процесса.
Повышение числа гликогенположительных лимфоцитов (до 70 - 80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно хронического лимфолейкоза.
При хроническом миелолейкозе содержание гликогена в гранулоцитах уменьшается приблизительно в 2 раза по отношению к норме, хотя общее его количество, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышенным вследствие лейкоцитоза.
При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено, после спленэктомии оно повышается до нормальных величин.
При острых лейкозах гликоген можно обнаружить в бластных клетках: при остром миелобластном лейкозе в виде мелкой зернистости в цитоплазме или в виде слабого диффузного ее окрашивания, причем в части бластов PAS-реакция отрицательная. При остром промиелоцитарном лейкозе наблюдается яркое диффузное окрашивание цитоплазмы. В монобластах реакция может быть отрицательной, слабо положительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляется в виде рассеянных мелких или средних гранул, располагающихся по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). При эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах, в виде диффузного окрашивания разной интенсивности - в нормобластах. Лимфобласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.
Цитохимическое исследование на гликоген можно проводить не только в мазках крови и костного мозга. Так, например, можно исследовать мазки влагалищного эпителия и по результатам исследования судить о функциональном состоянии яичников. В норме у женщин обнаруживают много гликогена в клетках, в то время как обеднение их гликогеном свидетельствует о нарушении функции яичников.
В опухолях количество гликогена различно: зрелые доброкачественные опухоли содержат много гликогена, в незрелых раковых опухолях количество гликогена резко уменьшено. Снижение гликогена в опухолевых клетках, вероятно, может быть использовано как показатель злокачественности опухоли.
| 
