ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.1.)
содержится преимущественно в зрелых нейтрофильных лейкоцитах; активность фермента связывают со вторичными (специфическими) гранулами цитоплазмы. Относится к группе гидролитических ферментов с оптимумом действия при рН 9,6, осуществляет гидролиз однозамещенных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено определение активности фермента методами азосочетания.
Метод азосочетания по Кеплоу.
Принцип.
Расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил-фосфата с освобождением а-нафтола, образующего с солями диазония нерастворимый окрашенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента.
Реактивы.
1. 10% раствор формалина в абсолютном метаноле.
2. 0,05 М раствор пропандиолового буфера (рН 9,75); готовят основной 0,2 М раствор (10,5 г 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола растворяют в 500 мл дистиллированной воды), хранят его в холодильнике. Из основного раствора готовят 0,05 М раствор (25 мл основного раствора буфера смешивают с 5 мл 0,1 н. раствора НСI и доводят дистиллированной водой до 100 мл), хранят в холодильнике.
3. а-Нафтилфосфат. Можно использовать нафтол-АS-фосфат, нафтол-АS-TR-фосфат или нафтол-АS-ВI-фосфат.
4. Прочный синий RR; можно использовать отечественные красители диазоль синий 2С и диазоль синий0.
5. 2 % раствор метилового зеленого.
6. Инкубационная среда (готовят перед употреблением): 35 мг а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR, 35 мл буферного раствора.
Специальное оборудование.
Холодильник.
Ход исследования.
Высохшие на воздухе мазки фиксируют в 10 % растворе формалина в абсолютном метаноле при температуре 0—5 °С в течение 30 с. На высохшие мазки наносят инкубационную среду после фильтрования и оставляют мазки при комнатной температуре на 8—10 мин. Ополаскивают в проточной воде в течение 10 с.
Докрашивают метиловым зеленым в течение 15 мин или гематоксилином Майера 3—4 мин.
Метод азосочетания (модификация М. Г. Шубина).
Принцип см. метод азосочетания по Кеплоу.
Реактивы.
1. 0,5 % раствор целлоидина в смеси равных количеств абсолютного спирта и эфира.
Целлоидин можно готовить из кино и фотопленок по методике Меркулова: удалить слой эмульсии после вымачивания в горячей воде или щелочи, выдержать 5—10 дней в трех сменах хлороформа, промыть спиртом, высушить, мелко нарезать и растворить в смеси абсолютного спирта с эфиром.
2. 0,5 М раствор тетрабората рН 9,18 [19,1 г тетрабората натрия (бура) растворить и довести дистиллированной водой до 1 л]. Раствор стойкий.
3. 0,1 % раствор а-нафтилфосфата в растворе тетрабората (готовят перед употреблением).
4. 0,2 % раствор диазоля синего 0 в растворе тетрабората (готовят перед употреблением и фильтруют в защищенном от света месте).
5. Гематаль 8 Бейкера: один объем 0,1 % гематеина, приготовленного на 50 % водном растворе этиленгликоля, смешивают с одним объемом 1,6 % водного раствора сульфата алюминия. Вместо гематаля можно использовать гематоксилин: 1 г краски растворяют в 50 мл дистиллированной воды, доводят до кипения, доливают 50 мл дистиллированной воды, добавляют 0,02 г йодата натрия и 5 г алюмокалиевых квасцов, встряхивают до растворения и охлаждают.
6. Инкубационная среда (готовят перед употреблением); равные количества реактивов 3 и 4.
Специальное оборудование.
Холодильник.
Ход определения.
Мазки фиксируют в 0,5 % растворе целлоидина в течение 3—5 с. После фиксации целлоидин с обратной стороны предметного стекла удаляют салфеткой, стекла ставят в вертикальном положении на фильтровальную бумагу и дают им высохнуть. Инкубируют в инкубационной среде при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 30 мин. Промывают в проточной воде в течение 5—10 мин и ополаскивают в дистиллированной воде. Докрашивают ядра красителем (реактив 5). При использовании гематаля 8 мазки окрашивают 18—24 ч, затем ополаскивают в дистиллированной и проточной воде и высушивают. При использовании гематоксилина мазки окрашивают 30—60 мин, ополаскивают в тетраборатном буфере, разведенном водопроводной водой, промывают водой и высушивают.
Нормальные в величины.
У здоровых людей большинство сегментоядерных нейтрофилов являются фосфатазоотрицательными и только в 20—30 % клеток выявлена слабая активность фермента ( + ). По данным М. Г. Шубина и Б. С. Нагоева, активность фосфатазы для здоровых обоего пола составляет 26 + 0,6 ед., или СЦК 0,26±0,006. Выявлено достоверное различие между показателями энзиматической активности у мужчин и женщин (соответственно 21 ±0,7 и 31 ±0,8 ед.).
Клиническое значение.
Наибольшее диагностическое значение имеет определение активности фермента при гемобластозах; снижение активности характерно для хронического миелолейкоза, повышение — рассматривают как один из признаков эритремии. Повышение активности наблюдается также при воспалительных процессах, интоксикациях, опухолях, коллагенозах, циррозах печени. Показатель может быть использован как дифференциально-диагностический признак при лейкемоидных реакциях (активность фермента повышена) и хроническом миелолейкозе. Снижение активности фермента часто сопутствует вирусному гепатиту, инфекционному мононуклеозу и другим вирусным инфекциям, лучевой болезни.
Литература.
Буйкис И. М., Рубенс Ю. Ф. Гистохимическое определение активности щелочной фосфатазы -методом одновременного азосочетания.— Вопросы лейкозологии (Рига), 1969, № 1,с. 369—376;
Шубин М. Г.— Лаб. дело, 1965, № 1, с. 10—14;
Шубин М. Г., Нагоев Б. С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии.— М.: Медицина, 1980, с. 41; Kaplow L. Blood, 1955, vol. 10, № 10, p. 1023—1029.
| 
