ДЕГИДРОГЕНАЗЫ — группа окислительно-восстановительных ферментов, локализующихся в митохондриях цитоплазмы клеток. Для исследования различных дегидрогеназ используют метод Нахласа с соавт. в модификациях, основанный на реакции восстановления солей тетразолия и выпадения осадка диформазана в местах активности ферментов.
СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗА
(СДГ; К Ф. 1.3.9.9.1). Метод Нахласа с соавт. (модификация Кваглино, Хейхо).
Принцип.
Активность фермента оценивается по реакции восстановления солей тетразолия в виде осадка диформазана синего цвета.
Реактивы.
1. 60 % водный раствор ацетона.
2. 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,4).
3. 0,2 М раствор сукцината натрия.
4. 0,6 М раствор бикарбоната натрия.
5. 0,03 М раствор хлорида алюминия.
6. 0,03 М раствор хлорида кальция.
7. Тетразолий нитро ВТ.
8. 0,1 % раствор прочного красного.
9. Инкубационная среда:
10 мл реактива № 3,
2 мл реактива № 4,
0,2 мл реактива № 5,
0,2 мл реактива № 6,
10 мг тетразолия в 10 мл дистиллированной воды, дистиллированной воды до 40 мл.
Специальное оборудование.
Термостат.
Ход определения.
Свежеприготовленные и высушенные на воздухе мазки фиксируют в ацетоне при комнатной температуре 30—60 с. Промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Инкубируют в инкубационной среде в течение 1 ч при 37 °С. Промывают дистиллированной водой. Докрашивают 0,1 % раствором прочного красного 10 мин.
================================================
Метод Нахласа с соавт. (модификация Р. П. Нарциссова).
Принцип тот же.
Реактивы.
1. 60 % раствор ацетона, насыщенный трилоном Б.
2 1 /15 М фосфатный буфер (рН, 7,2). (0,0044М)
3. Сукцинат натрия.
4. Пара-нитротетразолий фиолетовый.
5. Трилон Б.
6. 0. 5 % раствор метилового зеленого на ацетатном буфере (рН 5,0).
7. Инкубационная среда: 540 мг сукцината натрия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл буферного раствора (реактив № 2) и 10 мл раствора пара-нитротетразолия в дистиллированной воде(1 мг/мл), 13мгтрилонаБ (рН довести до 7,2) и дистиллированной воды до 40 мл.
Среда может быть пригодна 1—2 нед при хранении в холодильнике.
Специальное оборудование.
1. Термостат или водяная баня.
2. Холодильник.
Ход определения.
Фиксируют мазки ацетоном (реактив № 1) при комнатной температуре в течение 30 с. Ополаскивают дистиллированной водой 3—5 с и высушивают. Инкубируют в инкубационной среде в течение 1 ч при 37 °С. Промывают проточной водой в течение 1 мин. Ополаскивают дистиллированной водой 3—5 с. Докрашивают метиловым зеленым 5—10 мин. Промывают в проточной воде. Дополнительно фиксируют мазки парами формалина в течение 30 мин (для предотвращения растворения формазана нитротетразолия фиолетового в иммерсионном масле).
==============
а-ГЛИЦЕРОФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА (а-ГФДГ).
Метод Нахласа с соавт. (модификация Р. П. Нарциссова).
Принцип см. Сукцинатдегидрогеназа.
Реактивы.
1. 60 % раствор ацетона, насыщенный трилоном Б.
2. 1 /15 М фосфатный буфер (рН 7,2).
3. а-Глицерофосфат натрия.
4. Пара-нитротетразолий фиолетовый.
5. Трилон Б.
6. 0,5 % раствор метилового зеленого на ацетатном буфере (рН 5,0).
7. Инкубационная среда:
630 мг а-глицерофосфата натрия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл буферного раствора (реактив № 2), 10 мл раствора пара-нитротетразолия в дистиллированной воде (1 мг/1 мл), 13 мг трилона Б (рН доводят до 7,2) и дистиллированной воды до 40-мл. Среда пригодна в течение 1—2 нед при хранении в холодильнике.
Оборудование и ход определения
см. Сукцинатдегидрогеназа (модификация Р. П. Нарциссова).
Нормальные величины.
У здоровых СДГ и а-ГФДГ выявляются в виде гранул в нейтрофилах, лимфоцитах, тромбоцитах периферической крови и миелобластах, гранулоцитах, мегакариоцитах, эритро- и нормобластах костного мозга.
СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,1 ±0,05; а-ГФДГ—0,8 + 0,08. У детей активность фермента СДГ обнаружена в 46 % лимфоцитов. У здоровых взрослых в пунктате костного мозга около 88 % недифференцированных клеток имеют активность фермента ( + ), все ядерные элементы эритроидного ряда и гранулоциты проявляют активность на ( + ) и ( + + ).
********
Клиническое значение.
Снижение активности ферментов в лимфоцитах отмечено в период приступа бронхиальной астмы, при хроническом лимфолейкозе. Повышение активности ферментов обнаружено у больных злокачественными опухолями в гранулоцитах, снижение активности — при хроническом миелолейкозе.
Литература.
Нарциссов Р. П. Арх. анат., 1969, № 5, с. 85—91;
Nachlas М. М. et al. J. Histochem., Cytochem., 1957, vol. 5, p. 420— 436;
Quaglino D., Hayhoe F. Nature, 1960, vol. 187, № 4731, p. 85—86.
| 
