Методика выявления миелиновой оболочки по Шпильмейеру
Данная методика предназначена для элективного окрашивания миелиновых оболочек нервных волокон. Одновременно в белом веществе выявляется дренажная олигодендроглия.
Кусочки хранят в 10 % формалине, режут на замораживающем микротоме (толщина срезов 15 — 20 мкм). Срезы можно хранить также в 10 % формалине.
Методика окраски
1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
2. Переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, и подсушивают на воздухе.
3. Погружают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2 сут (можно дольше) и держат в темном месте.
4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и обезжиривают в 96 % спирте 15 — 30 мин.
5. Помещают в гематоксилин (15 мл гематоксилина Бемера и 85 мл дистиллированной воды) на 1 сут и держат на свету.
6. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и дифференцируют в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов (контролируя процесс под микроскопом).
7. Промывают в дистиллированной воде, затем оставляют на 30 мин в проточной воде.
8. Просушивают на воздухе, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Гематоксилин Бемера готовят из двух растворов. Первый раствор: 1 г гематоксилина в 10 мл абсолютного спирта; второй: 8 г алюмокалиевых квасцов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды, после чего раствор остужают и фильтруют. Через 1 сут после приготовления растворы смешивают и дают смеси созреть на свету в широкогорлом открытом сосуде 10—14 сут, после чего фильтруют и добавляют несколько кристаллов тимола.
Раствор железоаммонийных квасцов: 2,5 г железоаммонийных квасцов и 100 мл дистиллированной воды размешать и профильтровать.
Результаты: на светлом слегка желтоватом фоне миелиновые волокна темно-серо-синеватого оттенка; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе того же оттенка.
В одном препарате редко удается одновременно выявить касательные (тангенциальные) и проекционные волокна, потому что для выявления миелиновых волокон разных систем (интракортикальные, проекционные и спаечные) требуется различная длительность дифференцировки срезов в железоаммонийных квасцах. В связи с этим одно стекло со срезом, окрашенным гематоксилином, с тем чтобы получить четкую архитектонику волокон, а также тонкую структуру миелиновой оболочки проекционных волокон, нужно более длительно дифференцировать в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов, тогда как для выявления архитектоники волокон и структуры миелиновой оболочки касательных (тангенциальных) волокон другое стекло со срезом, окрашенным гематоксилином, погружают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на более короткий срок. В процессе окрашивания могут появляться артефактные контрастные белые пятна неокрашенной ткани. В таких случаях срезы нужно более длительное время обезжиривать в 96 % спирте.
Метод Шпильмейера в модификации Соколянского
Данный метод применяют для выявления миелиновых оболочек нервных волокон. С его помощью более четко определяется волоконная архитектоника и структура волокна, но хуже окрашивается миелин. Одновременно окрашивается дренажная олигодендроглия в белом веществе (при окраске головного мозга крыс лучше применять модификацию Соколянского).
Материал фиксируют в формалине.
Срезы толщиной 10 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме.
Методика окраски
1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
2. Переносят на смазанное белком покровное стекло и подсушивают.
3. Помещают в насыщенный раствор бихромата калия на 24 ч (можно на несколько суток) и держат на свету.
4. Ополаскивают в дистиллированной воде.
5. Переносят в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов и держат в темноте 24 ч (можно дольше).
6. Ополаскивают в дистиллированной воде (необязательно).
7. Окрашивают в течение 24 ч (можно дольше) на свету в гематоксилине (15 мл гематоксилина Бемера + 85 мл дистиллированной воды).
8. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды.
9. Дифференцируют в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов.
10. Промывают в дистиллированной и проточной воде, проводят через 96 % спирт, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
Результат: на сероватом фоне миелиновая оболочка центральных нервных волокон сиреневая; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе такого же оттенка.
Выявление миелиновой и нейрокератиновой оболочек по Авцыну
Материал фиксируют в формалине, заливают в желатин. Срезы толщиной до 10 мкм отмывают от формалина в 2 сменах дистиллированной воды, затем помещают в спиртовой раствор пиридина (чистый пиридин + 96 % спирт в соотношении 1:1) на 1 сут.
Методика окраски
1. Срезы промывают в 3 — 5 сменах дистиллированной воды и помещают в 0,5 % раствор нитрата серебра.
2. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.
3. Переносят в 10 % нейтральный формалин (3 порции, в каждой по 3 мин).
4. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.
5. Опускают в фосфорно-молибденовое серебро на 30 с.
6. Быстро ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.
7. Переносят в 10 % нейтральный формалин на 2 мин.
8. Погружают в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.
9. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (в той же банке).
10. Помещают в 10 % нейтральный формалин на 2 мин. И. Ополаскивают в дистиллированной воде.
12. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (так до 3 — 4 раз, а для выявления тангенциальных волокон — до 7 раз).
13. Переносят в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.
14. Осторожно натягивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином.
15. Подсушивают на воздухе 8—10 мин, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Для приготовления фосфорно-молибденового серебра берут 4 мл 20 % раствора нитрата серебра и 1 мл 1 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты, добавляют по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка, доливают до 15 мл дистиллированной воды.
Результат: на светло-сиреневом фоне определяются нейрокератиновая и миелиновая оболочки нервных волокон черного цвета; в сосудах выявляются эритроциты черного цвета.
Для получения этих результатов требуется тщательное соблюдение методических рекомендаций: свежий, прозрачный раствор фосфорно-молибденового серебра, соответствующей толщины срезы, химически чистая посуда. В противном случае фон становится интенсивно коричневым, а серебро, применяемое для выявления нервных волокон, выпадает в осадок в виде зерен черного цвета.
Выявление оболочек нервных волокон по Хеквисту
Материал (кусочки ткани размером до 3 см) фиксируют в формалине, продолжительность фиксации не ограничена. После фиксации кусочек промывают до исчезновения запаха формалина.
Затем кусочки помещают в 5 % раствор бихромата калия на 14 дней, промывают в проточной воде 24 ч, проводят через спирты (70 %, 96 % и 100 %) и заливают в парафин.
Методика окраски
1. Срезы проводят через 100 %, 96 %, 80 %, 70 % спирты и дистиллированную воду.
2. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на ночь. Одновременно готовят краситель (35 мл 1 % водного раствора метиленового синего + 35 мл 1 % водного раствора желтого или красного эозина, через 1 сут после приготовления растворы сливают и добавляют 120 мл воды).
3. Срезы быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят на ночь в краситель.
4. Ополаскивают в воде, быстро проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам.
Результаты: на синем фоне ткани миелиновая оболочка нервных волокон приобретает окраску от розовой до ярко-красной, осевые цилиндры окрашиваются в темно-синий цвет.
Рисунок миелинового волокна может иметь размытый фон при задержке ополаскивания в воде.
| 
