Выявление ганглиев и их островков

Выявление ганглиев и их островков

Среди методов импрегнации металлами первое место занимают методы импрегнации серебром Гольджи. Они основаны на образовании соединений серебра, которые осаждаются на отдельных ганглиозных клетках и их отростках, а также часто на глиальных клетках, сосудах и других образованиях. Наиболее распространен так называемый быстрый метод Гольджи. Во многих случаях вместо него можно использовать простой метод серебрения Шультце. Недостатком, но в то же время и достоинством метода Гольджи является то, что импрегнация никогда не распространяется на все клетки, ограничиваясь отдельными элементами. Благодаря этому получается картина, хотя и не полная, но более ясная, чем если бы были выявлены все клетки.

Метод Гольджи имеет большое значение не только для импрегнации нервных клеток, но и для выявления нервных окончаний, секреторных капилляров, железистых ходов, границ клеток и т.п. Хотя метод Гольджи позволяет получить лишь теневую картину, в соответствующих случаях с его помощью с успехом выявляют разнообразные тканевые элементы. При его использовании, конечно, нужно постоянно сознавать, что выявление структур основано на образовании осадка, который при известных обстоятельствах может дать картину не существующих в действительности структур. Нужно также учитывать, что выявленные клетки или структуры могут оказаться неполно импрегнированными. Какие именно образования будут импрегнированы, является в известной степени делом случая, так как условия, при которых происходит образование осадка, к сожалению, еще недостаточно известны. В связи с этим для правильной оценки полученных результатов требуются знания и опыт.

Ускоренный метод Гольджи

1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2,5 % (до 3,5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 — 25 °С в коричневую склянку на стек­лянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 — 6 кусочков. Ку­сочки не должны быть слишком большими или слишком малень­кими (толщина 2 — 3 мм, площадь поверхности 5 — 10 мм2).

Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 — 7 дней с промежутками около 12 ч.

2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0,75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до пре­кращения образования осадка, затем помещают на 1 — 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0,75 % раствора нитра­та серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.

3. Промывают в 40 % спирте (1 —2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 —4 ч, 4 % целлоидине 1 — 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.

Кусочки также можно поместить на 1—4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1:1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.

Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.

После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.

Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.

Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 —10-дневные животные). Особенно благоприятными объекта­ми являются головной и спинной мозг птенцов голубя.

Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 — 5 дней, для глии 2 — 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.

Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.

Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 — 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 — 3 % раствора бихромата калия и 4 —5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.

Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.

При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 — 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80—100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 — 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.

Медленный метод Гольджи

Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 — 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0,75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.

Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом

Оригинальная методика Гольджи

Данная методика является основной в изучении тонких структурных особенностей дендритов, шипиков и аксонной системы нейронов, позволяет более полно выявить морфологические особенности нейронов и межнейрональных связей.

1. Кусочки ткани мозга фиксируют в 10 % формалине от 1 до 15 дней. Увеличение продолжительности фиксации в формалине ухудшает качество импрегнации. Толщина кусочков не должна превышать 3 — 3,5 мм.

2. Фиксированные в 10 % формалине кусочки переносят (без промывания) на 3 сут в жидкость Мюллера в термостат.

3. Помещают (без промывания) в фиксатор, состоящий из 5 мл 1 % тетраоксида осмия и 25 мл 3 % бихромата калия, который готовят непосредственно перед использованием, ставят бюкс с притертой крышкой на 2 дня в термостат при температуре 37 °С. Для фиксации одного кусочка требуется не менее 30 мл указанной смеси.

4. Промывают кусочки в 2 сменах 1 % раствора нитрата серебра, приготовленного на 20 % растворе глюкозы.

5. Кусочки переносят в баночки из темного стекла на стеклянную вату и осторожно наливают раствор нитрата серебра на глюкозе (на 1 кусочек примерно 40 — 50 мл раствора). Обращаться с кусочками следует с большой осторожностью: брать их можно только пластмассовой или стеклянной лопаточкой, не следует пользоваться металлическим шпателем. Импрегнацию кусочков проводят в течение 14 — 20 дней в теплом месте.

Заливку в целлоидин проводят в течение 2 сут. Кусочки вырезают и наклеивают на блоки. Для более полного использования кусочков рекомендуется сделать на блоке подкладку из целлоидина, на которую кладут кусочек и заливают густым целлоидином. Кусочки подсушивают в парах хлороформа и помещают в 70 % спирт. Проводку по спиртам и заливку в целлоидин осуществляют в темноте, для этого баночки с кусочками следует покрыть колпачками из черной бумаги.

7. Режут кусочки на санном микротоме (толщина срезов 90—120 мкм). Серии срезов снимают с ножа кисточкой и помещают в 96 % спирт в чашки Петри, расправляя срезы кисточкой.

8. Каждый срез ополаскивают отдельно в 96 % спирте, затем переносят последовательно в две порции абсолютного спирта — в каждую на 30 мин.

9. Из 100 % спирта срезы переносят кисточкой на большие (60 х 90 или 32 х 40 мм) покровные стекла. Укладывают срезы в порядке серии. Стекла со срезами помещают в чашки Петри и осторожно заливают профильтрованным эвкалиптовым маслом. Если срезы при этом всплывают на поверхность, то их следует кисточкой вновь опустить на покровное стекло, помещенное на дно чашки Петри. В эвкалиптовом масле срезы должны находиться до просветления в течение 24 ч в темном месте. Эвкалиптовое масло можно использовать несколько раз (после фильтрации) до тех пор, пока оно не потемнеет.

Перед заключением в бальзам масло сливают, промокают срезы на покровных стеклах фильтровальной бумагой и заливают ровным слоем густого бальзама. После того как бальзам подсохнет (примерно в течение 3 сут), по краям покровного стекла со стороны бальзама приклеивают стеклянные, парафиновые или спичечные ножки.

Для приготовления жидкости Мюллера 3 г бихромата калия растворяют в 100 мл дистиллированной воды, можно подогреть, затем остудить и добавить 1 г сульфата натрия. Фильтровать раствор не нужно. Раствор хранят в темной стеклянной банке.

Результаты: на светло-желтом фоне выявляются нейроны с дендритами и аксонной системой, интенсивно импрегнированные в черный цвет.

Метод Гольджи—Дейнеки

(для выявления синапсов)

1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 % нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч.

2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2,5 мес.

3. Промывают в дистиллированной воде 3 — 4 мин.

4. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0,5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут.

5. Промывают в дистиллированной воде.

6. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь.

7. Переносят в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут).

8. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт.

9. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1,5 г тиосульфата натрия, 1,5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота).

10. Промывают 10 — 30 мин водопроводной, затем дистиллированной водой.

11. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 — 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты).

12. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавеле­вой кислоты на 1 — 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия).

13. Промывают дистиллированной водой и переносят в спирты восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %) по 2 —3 мин.

14. Проводят через карбол-ксилол 1—2 мин, 2 — 3 порции ксилола и заключают.

Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло-серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты — более интенсивно.

Метод Гольджи в модификации Блиновой

1. Материал фиксируют в 10 % формалине от 1 мес до 1 года (получены удовлетворительные результаты при фиксации в формалине более 1 года).

2. Кусочки ткани переносят в 2 % раствор бихромата калия (готовят на дистиллированной воде) на 2 сут в термостат при 25-30 °С.

3. Промывают в двух сменах 4 % раствора нитрата серебра, приготовленного на 20 % растворе глюкозы.

4. Помещают в такой же раствор нитрата серебра на 4— 5 сут при комнатной температуре в темном месте.

5. Не меняя раствор нитрата серебра, баночки с кусочками ткани переносят в термостат при 24 — 30 °С на 1 сут (более продолжительная импрегнация кусочков ткани в термостате ухудшает качество препаратов)

6. Кусочки ткани переносят в дистиллированную воду и получают срезы толщиной 40 — 50 мкм на замораживающем микротоме.

7. Обезвоживают срезы в спиртах восходящей концентрации (70%, 80%, 96%) и в 2 порциях 100 % спирта, проводят через ксилол, заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 4 % раствора нитрата серебра на 20 % растворе глюкозы растворяют 20 г глюкозы (можно заменить сахарозой) в 100 мл дистиллированной воды. В этот раствор добавляют 4 г нитрата серебра. В случае выпадения осадка раствору дают отстояться непосредственно перед применением. Подобным образом готовят и 1 % раствор нитрата серебра на 20 % растворе глюкозы.

Результат: на светло-желтом или почти бесцветном фоне нейроны с  дендритами и шипиками на них окрашены в интенсивно-черный цвет.

Метод Гольджи—Кокса (для животных)

1. Животное анестезируют нембуталом (эфир применять нельзя) в летальных дозах, затем берут кусочки головного мозга, быстро ополаскивают в теплом изотоническом растворе хлорида натрия и помещают в 50 мл следующей смеси: 20 мл 5 % раствора бихромата калия, 20 мл 5 % раствора сулемы, 40 мл дистиллированной воды. К этой смеси при постоянном помешивании добавляют 8 мл 5 % раствора бихромата калия. Кусочки в этом растворе помещают на стеклянную вату. Банки хранят в темном месте при комнатной температуре (не перемешивая) в течение 8 нед. Для коры головного мозга кошки, котенка и крысы этот срок меньше.

2. Кусочки без промывания ополаскивают в смеси равных количеств ацетона и 100 % спирта, затем помещают в такую же смесь на 24 ч в закрытой посуде.

3. Переносят в смесь равных количеств 100 % спирта и эфира на 4 ч.

4. Помещают в 5 % целлоидин на 24 ч, затем в 12 % целлоидин на 12 ч. Заливают на блоки и укрепляют хлороформом.

5. Срезы толщиной 100 — 120 мкм режут на микротоме в 70 % спирт.

6. Доводят до дистиллированной воды.

7. Осуществляют редукцию в 5 % растворе сульфата калия (к большому объему раствора добавляют несколько капель 5 % раствора щавелевой кислоты) для просветления фона и его обесцвечивания.

8. Промывают в дистиллированной воде в течение 5 мин. Проводят в смеси равных количеств спирта и хлороформа и наклеивают на предметное стекло 1 % раствором целлоидина.

9. Стекла со срезами проводят через смесь равных количеств абсолютного спирта и хлороформа.

10. Просветляют в скипидаре и заливают в бальзам.

Метод Глисса в модификации Владимировой

1. Небольшой кусочек ткани головного мозга погружают в жидкость Бодиана (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 90 мл 80 % спирта) на 3 — 4 дня.

2. Промывают в проточной воде в течение 24 ч.

3. Срезы толщиной 12 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают на 24 ч в 50 % спирт, добавив в него 10 капель крепкого аммиака.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в 10 % раствор нитрата серебра на срок от нескольких часов до 5 дней (пока срез не станет коричневым).

5. Не ополаскивая, переносят в 10 % формалин, меняя его несколько раз, пока не исчезнет муть.

6. Ополаскивают в проточной воде.

7. Погружают на 30 с (можно до 1 мин) в смесь, состоящую из 10 мл 100 % спирта и 10 мл 20 % раствора нитрата серебра (выпадающий осадок растворяют аммиаком, прибавляя его по каплям).

8. Переносят в 10 % формалин, меняя несколько раз до исчезновения мути.

9. Промывают в дистиллированной воде и помещают в 1 % раствор хлорного золота до появления стального цвета.

10. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия.

11. Промывают в дистиллированной воде.

12. Переносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, затем проводят через ацетон, ксилол, заключают в бальзам.

Результат: на сером фоне видны темные нервные клетки, ядра, нейрофибриллы в нервных клетках и синаптических волокнах, синаптические окончания.