Методика Снесарева
(выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон)
Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках — феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию.
Материал фиксируют в 10 % формалине.
Срезы толщиной 8— 10 мкм получают на замораживающем микротоме.
1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 — 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя).
2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски.
3. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 —40 с.
4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа).
5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая—Грюнвальда на 3 — 5 с.
6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 — 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой.
7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.
Для приготовления 0,5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 — 3 ч в термостат при 37 — 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным).
Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки — ядро и прилежащая цитоплазма,— становится розовой: от яркого цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета.
Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая — Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8—10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.
Методика Рамон-и-Кахаля
(выявление волокнистой и астроцитарной глии)
Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 — 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.
1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).
2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.
4. Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания.
5. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.
Результат: в белом веществе на сиреневом фоне (разной интенсивности) четко определяются черновато-фиолетовые фиброзные астроциты, а в сером веществе — более светлые.
Методика Мийагавы в модификации Александровской
(выявление мезенхимной глии)
Методику используют для выявления клеток микроглии, перицитов (гематогенных гистиоцитов), а также клеток олигодендроглии (плотных и дренажных). Одновременно обнаруживают зернистые шары и дельта-зернистость; в мягкой мозговой оболочке окрашиваются пигментные клетки (хроматофоры), могут выявляться фиброзные астроциты.
Материал фиксируют в 10 % формалине не менее 12 дней, затем промывают проточной водой в течение 2 сут и заливают в желатин. Вырезанные из желатина кусочки помещают в 10 % кислый формалин на 1 сут (в нем их можно длительно хранить). Перед резкой на замораживающем микротоме желательно промыть кусочки в проточной воде около 1 — 2 ч (материал лучше режется).
Толщина срезов 15-20 мкм.
Срезы хранят в 10 % кислом формалине.
1. Срезы промывают в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в 10 % кислый формалин на 20 мин (можно до 3 ч).
2. Переносят без промывания в щелочной раствор (1 капля гидроокиси натрия на 10 мл дистиллированной воды) на 40 —60 с.
3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды.
4. Импрегнируют в растворе аммиачного серебра 1 —2 мин.
5. Переносят в горячий 10 % кислый формалин, который подогревают под вытяжкой на спиртовке. В случае помутнения формалина его следует заменить. В горячем формалине срезы приобретают золотистый цвет.
6. Помещают в холодный 10 % кислый формалин (в нем их можно оставить до следующего дня).
7. Промывают в 2 — 3 сменах водопроводной воды, наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином и дают просохнуть на воздухе.
8. Просветляют в ксилоле (если на препарате видны мутные пятна, то его опускают на 2 — 3 с в ацетон и вновь переносят в ксилол до просветления), заключают в бальзам под покровное стекло.
В случае недостаточного выявления микроглии, особенно олигодендроглии, желатиновые срезы следует перенести из формалина, в котором их хранят, в смесь Дубранского (срезы перед этим промывают в 2—3 сменах дистиллированной воды) на срок от 2—3 сут до 2—3 нед, обязательно меняя смесь через 2—3 дня.
Для приготовления смеси Дубранского в 100 мл нагретой до кипения дистиллированной воды осторожно всыпают 6 г гидрокарбоната натрия, еще раз доводят до кипения, охлаждают, фильтруют. В полученный раствор добавляют 6 мл неразведенного нейтрального формалина и 6 капель 25 % аммиака.
Результат: на светло-янтарном фоне видны ветвистые клетки микроглии, перициты, плотные и дренажные клетки олигодендроглии, имеющие цвет от светло-коричневого до темно-коричневого. Дренажные клетки в белом веществе ткани головного мозга светло-коричневые, часто светло-желтые. Хроматофоры в мягкой мозговой оболочке, изредка в сосудах вещества мозга — черного цвета. Иногда в белом веществе коры и подкорковых образованиях одновременно выявляют волокнистые астроциты светло-коричневого цвета. Старческие бляшки имеют цвет от светло- до темно-коричневого.
Метод Хорнеца
(выявление фиброзных астроцитов)
Материал фиксируют в 10 % кислом формалине, срезы получают на замораживающем микротоме. Хорошие результаты удается получить также на материале, заключенном в парафин.
1. Срезы переносят в дистиллированную воду, на 100 мл которой добавлено 15 капель раствора аммиака (недолго).
2. Помещают в 5 % раствор бромисто-водородной кислоты на 1 ч при температуре 37 °С.
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды, а затем в дистиллированной воде, к которой добавлено несколько капель уксусной кислоты.
4. Переносят на 15—24 ч в раствор, состоящий из 1 г трихлорида золота в 75 мл дистиллированной воды +25 мл 2 % сулемы+18 мл дистиллированной воды + 15 капель уксусной кислоты, препараты приобретают темно-коричневую или красно-коричневую окраску.
5. Помещают в 5 % раствор щавелевой кислоты (до приобретения ими серой окраски).
6. Ополаскивают в дистиллированной воде, переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия с несколькими каплями раствора аммиака; быстро ополаскивают и заключают.
Результат: на сиреневом фоне выявляются темно-синие фиброзные астроциты с отростками, видны капилляры и красные эритроциты в их просвете.
Возможные осложнения: при использовании старого раствора бромисто-водородной кислоты и передержке в ней препарата выпадают артефактные синие глыбки неправильной формы.
| 
