Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность — 3 — 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные!) и применение чистых реактивов.
Импрегнация срезов
Материал фиксируют в растворе формалина (1:9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 —3 ч, затем в дистиллированной воде 1—2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной 5 — 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 — 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 — 4 раза.
Импрегнация:
1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;
2) быстро (2 — 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;
3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного серебра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия — образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0,875 — 0,910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 — 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 — 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;
4) быстро проводят через 2 — 3 порции дистиллированной воды;
5) восстанавливают в растворе формалина (1:4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, — срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;
6) промывают в воде 15 мин;
7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 — 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;
8) фиксируют 1—2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;
9) тщательно промывают в обычной воде (1—2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.
На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.
К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1:9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.
Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином
В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 — 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24— 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.
Тотальная импрегнация
Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 — 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0,5 — 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 —24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.
Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.
1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1:4 до 1:9), разрезают на кусочки толщиной не более 0,5 см и на 3 — 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.
2. Промывают 12 — 24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.
3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3 — 5 дней.
4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.
5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).
6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).
7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1:9) 10 — 12 ч.
8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.
При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.
Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.
М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.
Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 — 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.
С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.
Метод Адэра и Витгилию
(для выявления нейрофибрилл и синапсов)
Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 — 24 ч. Срезы толщиной 15—20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).
Далее проводят через дважды сменяемый спирт, промывают несколько раз в дистиллированной воде и обрабатывают 1 % трихлоридом золота до обесцвечивания. Промывают в 6 —8 порциях дистиллированной воды.
Для усиления окраски срезы обрабатывают 3 — 4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в 6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5—10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.
Результат: хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.
Методика Бильшовского
(выявление внутриклеточных нейрофибрилл, осевых цилиндров нервных волокон и сенильных бляшек)
Служит наиболее адекватной методикой для микроскопической диагностики болезни Альцгеймера и старческого слабоумия.
Материал фиксируют в 10 % формалине не менее 2 нед. Срезы толщиной 8—10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в 10 % формалине, перед окраской промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
1. Переносят срезы на 24 ч в 2 % раствор нитрата серебра.
2. Ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.
3. Переносят в аммиачное серебро на 25 — 30 с.
4. Тщательно ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.
5. Помещают в 20 % нейтральный формалин на 4 —5 с до приобретения темно-коричневой окраски.
6. Ополаскивают в дистиллированной воде.
7. Переносят 1—3 среза в 0,5 % раствор трихлорида золота (они должны приобрести светло-серый, мышиный, цвет без коричневых пятен).
8. Переносят в дистиллированную воду (если на срезах появятся коричневые пятна, то вновь помещают в раствор трихлорида золота до их исчезновения).
9. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. Стеклянную палочку после погружения со срезом в тиосульфат натрия следует тщательно промыть в дистиллированной воде, протереть чистой тканью. Переносить срезы из тиосульфата натрия в трихлорид золота не следует, так как последний в этом случае темнеет и становится непригодным для использования.
10. Срезы промывают в дистиллированной воде, наклеивают на стекло, смазанное смесью белка с глицерином, затем ставят на ребро для просушки на 8 — 10 мин.
11. Просветляют в одной порции ксилола и заключают в бальзам под покровное стекло. Если препарат просветлен не полностью, т.е. имеются мутные пятна, то его следует погрузить на 2 — 3 с в ацетон, а затем вновь поместить в ксилол. Эту процедуру повторяют до полного просветления срезов.
Результат: на светлом фоне импрегнируются контуры нейронов, их ядер; в телах нейронов выявляются тонкие волокна нейрофибрилл или их патология. Между клетками видна тонкая сеть аксонов и их коллатералей. Аксосоматические терминали на поверхности тел нервных клеток выявляют изредка и частично, поэтому о количестве их говорить нельзя. Иногда в белом веществе обнаруживают волокнистые астроциты.
При правильной предварительной фиксации материала с помощью этого метода постоянно получают хорошие результаты. Засорение срезов осадками серебра происходит при использовании плохо обработанной посуды и недоброкачественного раствора серебра. При недостаточной дифференцировке в растворе трихлорида золота структуры выглядят грубо импрегнированными с коричневым оттенком, в срезе определяются коричневые пятна.
| 
