Нейрогистологические методы в изучение мозга и поведения
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И НЕЙРОАНАТОМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Во многих опытах и методах, по исследованию мозга и поведения, предполагается непосредственное манипулирование с мозгом, как, например, введение стимулирующих или регистрирующих электродов, инъекционных канюль и нанесение различных типов повреждений. В данной главе приведены основные гистологические методики, которые применяются для уточнения положения имплантированных электродов и канюль и для определения объема экспериментальных разрушений мозга
ПЕРФУЗИЯ
Оборудование.
Химические ножницы (большие и малые), две пластмассовые бутылки (2—5 л), резиновая трубка и трехканальный вентиль.
Рис. 1. Система для перфузии
Перфузирование животного производится через систему кровообращения для доставки выбранного фиксатора (например, глутаровый альдегид, этанол и формалин). Жидкость поступает под давлением, которое примерно соответствует нормальному кровяному давлению животного. Это достигается, если, например, подвесить бутыль, содержащую перфузирующую жидкость, на высоту около 150 см над животным. Перфузионная система показана на рис. 1.2; она состоит из двух бутылей (одна содержит физиологический раствор, а другая — перфузирующую жидкость), раздваивающейся системы резиновых или полиэтиленовых трубок и трехканального вентиля.
Трехканальный вентиль позволяет последовательно вливать различные растворы. В перфузионной системе важно не допускать появления пузырьков воздуха.
Перед перфузированием наркотизированное животное кладется на спину, на его грудной клетке делается надрез (справа и слева от грудины). Канюля, прикрепленная к резиновой трубке, вводится затем в левый желудочек, и начинается подача физиологического раствора. В правом желудочке для дальнейшего быстрого замещения крови физиологическим раствором (рис. 1) делают небольшой надрез.
После того как физиологический раствор вымыл кровь, формалиновая перфузирующая жидкость начинает поступать через систему кровообращения животного.
О том, что перфузирование проведено правильно, можно узнать по реакции перфузирующей жидкости с белками клеток, вызывающей тремор мышц. Когда животное окостеневает и объем пропущенной перфузирующей жидкости соответствует его утробной массе, можно удалять мозг из черепа.
Для приготовления 10%-ного забуференного раствора формальдегида (pH 7,3—7,5) необходимо растворить 9 г NaCl, 4 г моногидрата дигидрофосфата натрия (NaH2P04-H20) и 8,35 г дигидрата гидрофосфата натрия (Na2HP04-H20) в 900 мл дистиллированной воды; затем добавить 100 мл готового раствора формалина (37,5%). Такой 10%-ный раствор забуференного формальдегида приготавливается на основании того, что обычный готовый формальдегид имеет 37,5%-ную концентрацию. Таким образом, концентрация 10%-ного формалина составляет 3,75% забуференного раствора формальдегида. Раствор хранится в прохладном месте.
При большем pH уменьшается количество связанного белка в клетках и таким образом снижается качество последующего окрашивания, так как большинство процедур окрашивания зависит от реакции с белками. Поэтому формалин действует наиболее эффективно в виде забуференного 10%-ного раствора, pH которого 7,5.
Если перфузия не удалась, голову животного отделяют от туловища и раскрывают череп как можно полнее. Затем голову помещают в 10%-ный забуференный раствор формалина и мозг затвердевает, находясь при этом в черепе.
Процедура занимает 1—2 недели. После этого мозг осторожно извлекают (см. раздел 1.4.2) из черепа и удаляют твердую мозговую оболочку. Мозг режут на блоки толщиной около 5 мм; блоки оставляют в 10%-ном забуференном формалине еще на две недели. Далее следует действовать так же, как в случае интракардиальной перфузии животного.
ИЗВЛЕЧЕНИЕ МОЗГА
Инструменты. Большие хирургические ножницы, пинцет и узкие кусачки.
Отсеките голову животного и удалите столько мышц, сколько необходимо для обнажения черепа. Подцепите имплантированные электроды или канюли пеаном и осторожно снимите их с черепа вместе с закрепляющим зубным цементом. Начинайте удалять кость, лежащую над стволом мозга, осторожно отцепляя ее кусачками. Удалите столько кости, сколько нужно, чтобы можно было приподнять мозг и перерезать черепные нервы ножницами. Поместите мозг в 10%-ный раствор формалина на один день, прежде чем начнете работать с ним. Перед тем как разрезать мозг, пометьте одно полушарие продольным разрезом сбоку, чтобы не перепутать полушария.
ИЗГОТОВЛЕНИЕ БЛОКОВ ТКАНИ МОЗГА
Прослеживание электродных треков и идентификация разрушенных участков мозга значительно облегчается, если делать срезы параллельно плоскости погружения электродов в соответствии со стереотаксическим атласом, который
использовался во время опыта. Для этого мозг необходимо разрезать на некотором расстоянии от участка, представляющего интерес, в соответствующей коронарной плоскости.
Рис.3. Устройство для изготовления блоков ткани
 
|
С помощью двух таких разрезов, сделанных на расстоянии 2—3 мм кпереди и кзади от той части мозга, которая исследуется гистологически, отделяют блок ткани, который можно сразу перенести на столик замораживающего микротома. Точность разрезов при изготовлении блоков обеспечивает их максимальное сходство с картами стереотаксического атласа и позволяет проследить вертикальные треки на отдельном срезе по всей их длине.
Для воспроизведения стереотаксических координат, соответствующих размерам черепа, извлеченный мозг в перевернутом виде помещают на горизонтальную пластинку. Поверхности мозжечка и большого мозга соответствуют плоскости брегма-лямбда, а пограничная линия между мозжечком и большим мозгом указывает на уровень лямбды. На рис.3 приведено простое приспособление, удобное для разрезания мозга крысы на блоки. Оно состоит из узкой камеры, изготовленной из плексигласа (20X30X25) [мм], с вертикальными прорезями (S) шириной 0,3 мм, сделанными в боковых стенках с регулярным интервалом в 1 мм. Плексигласовая платформа (Р) может быть наклонена таким образом, что верхние поверхности мозжечка и полушарий большого мозга располагаются по отношению к вертикальным прорезям под углом ср, что также обеспечивает соответствие используемому стереоскопическому атласу. Лезвием бритвы, вставленной в определенные отверстия в стенках камеры, разрезают мозг в коронарной плоскости на нужном уровне.
ИЗГОТОВЛЕНИЕ СРЕЗОВ
Метод изготовления замороженных срезов широко используется и отвечает многим целям исследования. По сравнению с методами заливки мозга в парафин и целлоидин его преимуществом является то, что подготовка к изготовлению срезов занимает мало времени, с помощью метода замороженных срезов ткань обычно режут толщиной от 25 до 100 мкм. Если срезы должны быть более тонкими, то мозг необходимо заливать в парафин, что позволяет изготовлять срезы толщиной от 2 до 15 мкм.
1. Обезвоживание мозга и заливка его в парафин
Для изготовления срезов из незамороженного материала необходима гомогенная стабильность мозговых структур. Тонкие и равномерные срезы могут быть получены путем заливки мозга в парафин (парапласт) (см. также Humason, 1979).
Так как мозг содержит от 70 (в волокнах) до 80% воды (в клетках), то его нужно обезвоживать, замещая воду заливочным материалом. Для удаления воды можно использовать соединения, обладающие большим сродством к ней (например, этанол). Чтобы свести повреждение ткани до минимума, эти соединения используют в возрастающих концентрациях. Тем не менее при обработке мозг уменьшается в объеме почти на 7%. В качестве примера обезвоживания изопропанолом (изопропиловый спирт) и заливки в парапласт (парафин) приводится следующая процедура:
День
| Время, ч
| Обработка
|
| 11,00
| Изопропанол (50%-ный)
| 1
| 21,00
| Изопропанол (75%-ный)
| 2
| 11,00
| Изопропанол (96%-ный)
| 3
| 11,00
| Изопропанол (96%-ный)
| 4
| 11,00
| Изопропанол (100%-ный)
| 5
| 11,00
| Метилбензоат
|
| 19,00
| Бензол
|
| 19,30
| Бензол парапласт
|
| 21,00
| Парапласт (расплавленный парафин) 56—58°С
| 6
| 19,00
| Приготовление блоков в коробке из алюминиевой фольги
|
После того как блок затвердеет, залитый мозг готов для изготовления срезов.
2. Изготовление замороженных срезов
Для изготовления замороженных срезов (в криостате или на замораживающем микротоме) мозг обрабатывается растворами формалина с сахарозой в следующем порядке.
После извлечения из черепа мозг сначала помещают в 100%- ный раствор сахарозы с формалином (СФ) (100 г сахарозы на 1000 мл 10%-ного забуференного раствора формалина). На следующий день мозг переносят в 20%-ный раствор СФ, а на третий— в 30%-ный. Объем раствора СФ должен примерно в 20 раз превышать объем мозга. Мозг можно перфузировать также 5%- ным раствором формалина, а затем поместить его непосредственно в 30%-ный СФ. Сахароза мешает образованию кристаллов льда при изготовлении срезов. Эти кристаллы существенно ухудшают качество срезов. Как только мозг пропитается 30%-ным СФ, его специфическая масса начинает превышать массу раствора и он погружается на дно сосуда. Это значит, что мозг готов для изготовления срезов. Мозг может оставаться в растворе СФ в течение нескольких недель. Если его хранить там слишком долго, он становится твердым и его труднее резать.
Некоторую сложность представляет прикрепление мозга к поверхности столика микротома. Один из способов надежной фиксации ткани мозга — это изготовление желатиновой подложки.
Необходимы следующие материалы: 9 небольших ложек желатина и 500 мл Н20. Смешайте желатиновый порошок с водой, прокипятите и вылейте жидкость в плоскую чашечку для медленного застывания при комнатной температуре. Желатин можно хранить в холодильнике, при этом добавление нескольких капель формалина препятствует заплесневению, а алюминиевая фольга — высыханию желатина. Если необходимо, желатин можно использовать по частям.
Слегка подогрейте желатиновую подложку под струей воды и поместите ее на микротомный столик, мозг положите сверху. Замораживание производите медленно и равномерно, желательно на микротоме, замораживающем снизу. Когда мозг станет твердым и замороженным, его можно резать. Температура резания должна быть от —7 до—15°С. Если температура слишком низкая, то срезы либо скручиваются, либо дают трещины.
Замороженные срезы могут также изготовляться из блоков, полученных путем заливки кусочка мозга в желатин. Для этого мозг оставляют в водных растворах желатина с концентрациями 12,5 и 25% в каждом растворе в течение 6 ч при +37°С. После этого мозг помещают в небольшую банку, содержащую 25%- ный водный раствор желатина, и хранят в холодильнике. Закрепленный в желатине образец затем режется в криостате.
Важно, чтобы ткань не разрывалась, угол наклона ножа при резании был около 30° . Если угол наклона слишком велик или слишком мал, то срез может сморщиться или быть неровным. Режьте медленно и спокойно. Время от времени продолжайте заморозку при изготовлении срезов толщиной 30 мкм. Срезы ткани мозга должны сниматься с ножа движением кисточки, направленным книзу. Старайтесь не прикасаться кисточкой к лезвию ножа, так как можно повредить нож. Поместите срезы ткани в 0,5—1,0%-ный раствор формалина. На этой стадии ткань можно хранить в холодильнике для дальнейшей обработки срезов.
ПОДГОТОВКА ЖЕЛАТИНИЗИРОВАННЫХ ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКОЛ
Наклеивание срезов мозга на предметные стекла представляет сложную процедуру, которая может быть решена путем желатинизирования этих стекол. Это трудоемкий, но надежный метод.
Материалы, необходимые для очистки предметных стекол. 100 г дихромата калия (К2Cr2О7), 850 мл Н20 и 100 мл серной кислоты (H2SO4). Для приготовления раствора хромовой кислоты растворите дихромат калия в воде, затем добавьте серную кислоту.
Материалы, необходимые для покрытия желатином предметных стекол. 10 г желатина в порошке, 0,25 г хромовых квасцов и 500 мл дистиллированной воды.
Предметные стекла помещают в раствор хромовой кислоты на 48 ч. Желательно стекла ставить в штативы так, чтобы они не касались друг друга. Стекла промывают под струей горячей воды в течение 2 ч, а загем в течение 15 мин—деионизированной водой. Предметные стекла должны полностью высохнуть, но так, чтобы на них не попала пыль. Далее их дважды погружают в теплый желатин (способ его приготовления приведен ниже) и помещают в сушильный шкаф (30°С). Медленно высыхающий желатин образует ровную поверхность, к которой хорошо будут прикрепляться срезы ткани мозга.
Для приготовления желатина порошкообразный желатин смешивают с дистиллированной водой и помещают в сушильный шкаф при 62°С или в водяную баню, чтобы он растворился. К раствору желатина необходимо добавить хромовые квасцы. Затем смесь нужно дважды профильтровать; для быстрой фильтрации жидкости нагрейте аппаратуру перед использованием и держите колбу на горячей плите или в водяной бане (50°С). Профильтрованный желатин готов к употреблению.
Есть еще один легкий и быстрый способ покрытия предметных стекол желатином. Растворите 0,5 г желатина и 0,05 г сульфата хромистого (III) калия в 100 мл дистиллированной воды при 60-70°С. Погрузите поднос со стеклами в этот раствор на 20 с, а затем дайте им высохнуть. После сушки в термостате (40°С) предметные стекла можно использовать.
МОНТИРОВАНИЕ СРЕЗОВ
Материалы. Мелкая чашка и небольшая кисточка с заостренным кончиком.
Перенос срезов мозга на предметные стекла требует некоторого навыка. Срезы можно легко перенести из одного раствора в другой с помощью кисточки. Поместите срез (который необходимо натянуть) в мелкую чашку, наполненную 0,5—1%-ным формалином или водой. Положив покрытое желатином предметное стекло под ткань, осторожно и тщательно натягивайте на него срез. Аккуратно прикоснитесь к ткани кисточкой, медленно удаляя воду со стекла. Ткань приклеится к желатину. Не меняйте положение среза мозга после удаления воды. Старайтесь не намочить уже приклеенный срез при натягивании следующего среза.
Если стекла покрывали желатином по второму способу (желатин плюс сульфат хромистого калия), то необходимо приготовить желатин для монтирования срезов.
Для этих целей растворите 0,75 г желатина в 40 мл дистиллированной Н2О при 60—70°С. Затем добавьте 20 мл дистиллированной воды и 40 мл чистого этанола. Этот раствор нужно хранить в холодильнике. Чтобы натянуть срезы, сначала поместите их в чашку Петри с подогретым на теплой плитке желатином (до 35°С).
После монтирования срезов предметные стекла маркируют с помощью стеклографа.
ФОТОГРАФИРОВАНИЕ НЕОКРАШЕННЫХ СРЕЗОВ
На этой стадии простую гистологическую оценку можно осуществить, помещая монтированный срез под цифровой фотоаппарат укрепленный на штативе. Смочите срез глицерином. Позитивный отпечаток выявляет миелинизированные волокна, но не ядра серого вещества. Если мозг был правильно разрезан на блоки, то таких фотографий достаточно для определения путем сравнения с соответствующей коронарной плоскостью на атласе. Грубая реконструкция повреждений достигается с помощью сопоставлений фотографий с атласом.
ОКРАШИВАНИЕ
Ниже описывается несколько методов окрашивания. По этим методикам срезы обычно монтируются на покрытые желатином предметные стекла и высушиваются перед окрашиванием.
1. Окрашивание крезилвиолетом
Для приготовления этого красителя растворите 0,25—0,5 г крезилвиолета в 100 мл дистиллированной воды.
Приготовленный раствор перемешивают, фильтруют и хранят в темном сосуде при комнатной температуре. Раствор может храниться неограниченное время.
Перед окрашиванием срезы обезвоживают путем инкубации в 50%-ном этаноле, затем последовательно в 70, 96 и 100%-ном этаноле, в каждом случае в течение 10 мин. Потом срезы помещают в ксилол на 1—2 ч, где их можно даже оставить на ночь. После этого срезы вновь обезвоживают, помещая в 96, 70 и 50%- ные растворы этанола (2—5 мин в каждом растворе), а затем в дистиллированную воду (5 мин). Срезы погружают в раствор крезилвиолета на 15—60 с. Затем их промывают в дистиллированной воде и дифференцируют в подкисленном спирте (раствор, состоящий из 96%-ного этанола с добавлением нескольких капель уксусной кислоты). После двух смен раствора этанола срезы просветляют последовательно в двух порциях ксилола и заключают под покровные стекла. Для этого вынимают предметное стекло из ксилола и дают ему высохнуть в течение 10 с, затем наносят несколько капель канадского бальзама на ту сторону стекла, где расположены срезы, и накрывают сверху покровным стеклом. Следует позаботиться о том, чтобы не было пузырьков воздуха. Стеклам дают высохнуть. Раствор крезилвиолета может использоваться для идентификации дегенерированной ткани мозга: он окрашивает вещество Ниссля интактных нейронов в синий цвет.
О хроматолизе, набухании перикариона и эксцентричности ядра дегенерирующих нейронов свидетельствуют размытые зоны в нервной ткани.
2. Нейтральный красный
Для приготовления этого красителя 1 г нейтрального красного растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Затем туда добавляют 4 мл ацетатного буфера (pH 4,8). Ацетатный буфер состоит из 500 мл 0,1 N уксусной кислоты, смешанной с 750 мл 0,1 N ацетата натрия. Перед использованием раствор нужно профильтровать, кроме того, его можно подогреть для улучшения окрашивания глыбок Ниссля. Они имеют оранжево-красную окраску и выделяются на бледном светло-оранжево-коричневом фоне.
Когда используют крезилвиолет или нейтральный красный, то перед дифференцировкой в 96%-ном спирте можно произвести несколько коротких инкубаций (1 мин на каждую инкубацию) соответственно в 50, 70 и 96%-ном этаноле. Кроме того перед помещением срезов в ксилол их можно короткое время выдержать в смеси из равных частей 96%-ного этанола и ксилола.
Рекомендуется перед тем как накрыть срезы покровным стеклом, ксилол обновлять два раза. В последней порции срезы должны находиться не менее 5 мин.
3. Окрашивание по методу Клювер-Баррера
Как нейтральный красный, так и крезилвиолет можно сочетать с окрашиванием быстрым голубым люксолем миелинизированных волокон (Kluver—Barrera, 1963; Lockard and Reers, 1962) для окрашивания по методу Клювер—Баррера.
Для приготовления 0,1%-ного раствора быстрого голубого люксоля 1 г красителя растворяют в 1000 мл 96%-ного этанола; затем добавляют 5 мл 10%-ной уксусной кислоты. Раствор перемешивают, фильтруют и выдерживают перед использованием в течение 24 ч. Раствор хранится неограниченное время.
Для окрашивания с помощью быстрого голубого люксоля срезы предварительно выдерживают в 96%-ном этаноле в течение 10 мин, а затем переносят в раствор быстрого голубого люксоля и помещают на 2—4 ч в термостат при 56°С. Когда окрашивание завершено, волокна имеют темно-синий, а клетки — светло- синий цвет. Срезы осветляют в 96%-ном этаноле, затем споласкивают в дистиллированной воде и помещают в 0,05%-ный водный раствор карбоната лития на 5 мин.
Последний приготовляется из 0,5 г карбоната лития, растворенного в 1000 мл дистиллированной воды.
Срезы дифференцируют в 70%-ном этаноле в течение 1—3 мин и промывают дистиллированной водой. Последовательное промывание в карбонате лития и 70%-ном этаноле можно повторить несколько раз, если дифференцировка оказалась неудовлетворительной.
Теперь срезы можно подкрасить крезилвиолетом (6—10 мин) или нейтральным- красным (2—4 мин) согласно уже описанным процедурам. Однако следует отметить, что срезы выдерживают в крезилвиолете 6—10 мин вместо нескольких секунд, так как не производилась предварительная инкубация в ксилоле. При комбинировании крезилвиолета и быстрого голубого люксоля тела клеток и миелинизированные аксоны окрашиваются в два различных оттенка синего цвета. При комбинировании нейтрального красного и быстрого голубого люксоля тела клеток окрашиваются в оранжевый цвет, а миелинизированные волокна — в синий.
Каждая из этих процедур может быть использована отдельно или в комбинации (нейтральный красный плюс быстрый голубой люксоль или крезилвиолет плюс быстрый голубой люксоль) для обычного окрашивания после разрушений мозга, вживления электродов, после перерезок и т. д. Быстрый голубой люксоль не позволяет производить четкую дифференциацию нормальных и дегенерированных волокон. Для такой дифференциации есть специальная методика импрегнирования серебром.
| 
