Организация и оснащение патогистологической лаборатории
Гистологическая (патоморфологическая) лаборатория размещается в типовом или специально приспособленном помещении. Она должна быть оснащена необходимыми оборудованием, инструментами, лабораторной посудой и химическими реактивами.
Рабочие помещения лаборатории — комната, в которой производят вырезку секционного, биопсийного или экспериментального материала; рабочая комната лаборантов; комната для размещения аппаратуры и моечная.
Рабочие помещения должны быть оснащены приточно-вытяжной вентиляцией.
В лаборатории необходимо строго соблюдать правила противопожарной безопасности и работы с летучими и токсичными веществами.
В рабочей комнате лаборанта должны быть вытяжной шкаф, химический и физический столы, шкаф и сейф для хранения химических реактивов. Лабораторная мебель, выполненная из древесины, малопригодна для работы с многими токсичными веществами, используемыми в патоморфологии, поскольку затруднена ее последующая санитарная обработка, поэтому предпочтение следует отдавать специальной лабораторной мебели из металла и пластика, которая снабжена выдвижными частями, подводкой воды, вакуума, воздуха и газа. Рабочий стул должен иметь регулируемую высоту сиденья и спинки и легко перемещаться по полу.
Перечень необходимого оборудования лаборатории включает технические и аналитические весы, рН-метр, микротомы (санные, ротационные, замораживающие), криостат или криокит, водяную баню, столик для расплавления парафиновых срезов, комплекты автоматических пипеток, термостаты, холодильники, микроскопы, автоматы для проводки материала и др.
ЛАБОРАТОРНОЕ СТЕКЛО, ПОСУДА, ИНСТРУМЕНТЫ
Бесперебойная работа любой гистологической лаборатории возможна лишь при наличии достаточного набора лабораторного стекла и посуды. Наиболее часто используют чашки Петри,
банки с притертыми пробками, бюксы, кюветы, химические стаканчики, предметные и покровные стекла.
Чашки Петри — плоские, широкие стеклянные чашки с крышками — используют для вырезки биопсийного материала, в них можно окрашивать «свободно плавающие» срезы, ставить гистоэнзиматические реакции в термостате и т.д.
Банки с притертыми пробками вместимостью 1 — 3 л чаще используют для приготовления музейных макропрепаратов, хранения и фиксации кусочков тканей, обезжиривания предметных стекол в смеси Никифорова или кислотах. Большие банки можно применять для хранения летучих веществ. Банки вместимостью 50 — 200 мл чаще используют для хранения летучих химических реактивов, а также для подготовки кусочков тканей к заливке (в такой посуде проводят материал, полученный при гастро- и бронхобиопсии, а также пункционных биопсиях).
Бюксы стаканчики различной вместимости (чаще 10 — 100 мл) с притертой пробкой, которые используют для проведения гистологических окрасок и гистохимических реакций. Для постановки реакции на целлоидиновых и замороженных срезах применяют плоские бюксы диаметром около 50 мм.
Кюветы — прямоугольные стаканчики различной высоты с крышками — используют при проведении гистологических, гистохимических, ферментохимических реакций для одновременной окраски нескольких срезов, наклеенных на предметные стекла.
Химические стаканчики вместимостью 50 — 100 мл используют для проведения гистохимических и ферментохимических реакций.
Предметные стекла размером 76 х 26 мм и толщиной 2 мм служат для приготовления гистологических препаратов. Для проведения гистохимических, в том числе гистоэнзиматических, реакций желательно использовать стекла толщиной 1 мм.
Покровные стекла — тонкие и хрупкие стеклянные пластинки толщиной 0,15 — 0,2 мм. Чаще используют покровные стекла размером 18 х 18 и 24 х 24 мм.
В лаборатории должны быть также воронки разных размеров, фарфоровые стаканчики, ступки и мерная посуда (колбы, стаканы, цилиндры и мензурки).
Колбы из термостойкого стекла позволяют готовить реактивы, требующие нагревания. Большие колбы, как правило, служат для проточной и дистиллированной воды, а маленькие с притертыми пробками пригодны для хранения химических реактивов.
В патогистологических лабораториях применяют простые и градуированные пипетки. Вместимость последних составляет обычно от 0,1 до 100 мл; их используют при постановке гистохимических реакций и приготовлении реактивов.
Вся используемая лабораторная посуда должна быть снабжена этикетками и рационально размещена, что позволяет избежать ошибок при ее применении.
В набор используемых в гистологической лаборатории инструментов входят пинцеты (хирургические, анатомические и глазные), ножницы (анатомические, хирургические и глазные), скальпели, препаровальные иглы, шпатели — прямые и изогнутые металлические лопатки (чаще применяют при приготовлении срезов на замораживающем микротоме и целлоидиновых срезов), хирургические ножи для вырезки материала и ножи с двойным лезвием для получения тонких срезов ткани мозга. Для вырезки мелких объектов используют лезвия безопасной бритвы.
УЧЕТНАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ И ЕЕ ВЕДЕНИЕ
Правильное ведение учетной документации позволяет сотрудникам патогистологической лаборатории эффективно использовать рабочее время и облегчает работу с архивным материалом.
К документации, ведение которой является обязательным, относятся: алфавитный журнал для регистрации биопсийного и операционного материала; журнал регистрации выдачи биопсийного и журнал регистрации секционного материала; направления на патогистологическое исследование.
Кроме того, у старшей сестры (старшего лаборанта) должны быть книги учета спирта, ядовитых химических реактивов, драгоценных металлов, медикаментов и каталог учета химических реактивов, по которому легко находят нужный для работы реактив.
ПОДГОТОВКА ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКОЛ
Предметные стекла, применяемые для получения гистологических препаратов, необходимо предварительно подготовить. Исключение составляют готовые к использованию и специально упакованные импортные предметные стекла.
Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят в 2 — 3 % растворе гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают горячей водой и промывают в течение нескольких часов в проточной воде. Вымытые стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в смесь Никифорова: 96 % спирт и эфир (1:1). Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из этой смеси, протирают чистой тканью и складывают в коробочку.
Для обезжиривания предметных стекол используют также хромовую смесь, в состав которой входят 100 г бихромата калия, концентрированной серной кислоты и 1000 мл горячей воды. Бихромат калия растворяют сначала в горячей воде, затем раствор охлаждают и после этого по стеклянной палочке осторожно по каплям добавляют серную кислоту. Стекла выдерживают в хромовой смеси 2 — 3 дня, а затем тщательно промывают в проточной воде в течение 1—2 дней.
Предметные стекла также хорошо обезжириваются в крепком растворе соляной кислоты. Через несколько суток их промывают проточной водой и высушивают.
Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю.
Для лучшей фиксации срезов на стекле его предварительно смазывают смесью белка с глицерином. Свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Применяют также смесь, в состав которой входят 15 мл сыворотки крови, 5 мл дистиллированной воды и 6 мл 5 % формалина. После фильтрации смесь готова к нанесению на предметные стекла. Ее использование дает лучшие результаты, чем применение яичного белка, так как при окрашивании не образуется фон.
Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5 — 6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне, так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка.
Разработан способ фиксации среза к предметному стеклу без предварительного натирания последнего белком с глицерином. В ванночку с теплой дистиллированной водой капают несколько капель жидкого казеинового клея и перемешивают. В полученную мутноватую жидкость опускают срезы, расправляют препаровальной иглой и вылавливают на чистое обезжиренное стекло. Этот способ дает неизменно хороший эффект и вокруг среза отсутствует окрашенный фон, как это часто бывает при применении белка.
ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ
С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ МАТЕРИАЛОМ
Экспериментальные исследования являются составной частью многих научных работ во всех областях медицины и биологии. Современные фармакология и токсикология, достижения в хирургии и терапии базируются на эксперименте. Большая часть экспериментов — это уникальные многоплановые исследования, позволяющие использовать широкий спектр методов фиксации, применять различные гисто- и цитохимические методики, электронную микроскопию, гисторадиоавтографию, культуры тканей.
Основными объектами экспериментальных исследований в отечественных лабораториях являются млекопитающие: мыши, крысы, морские свинки, хомяки, кролики, кошки, собаки. Особенности содержания этих животных и работы с ними описаны в ряде руководств и монографий [Гиндце В.К., 1937; Ковалев¬ский К.Л., 1948, 1951; Гамбарян П.П., 1955; Западнюк И.П. и др., 1974; Лоскутова З.Ф., 1980; Е. Fariss, 1942], а также в периодических изданиях, например в журнале «Ветеринария».
ВЫВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
ИЗ ЭКСПЕРИМЕНТА, ВСКРЫТИЕ И ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА
Морфологи чаще всего начинают работу с лабораторными животными во время выведения их из эксперимента, поэтому необходимо знать Международные правила гуманного отношения к животным. Они отражены в Санитарных правилах по оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).
Перед выведением из эксперимента (за 12 ч) животных прекращают кормить. Умерщвление животного нельзя производить в присутствии других животных. Наиболее приемлемым способом эвтаназии признана передозировка наркотических средств (летальная доза). В остром опыте животное необходимо умерщвлять до прекращения наркоза.
Мелких животных (мыши, крысы, птицы, лягушки) допускается подвергать эвтаназии методом декапитации в том случае, если для исследования необходимо взять артериальную кровь, а также с помощью ингаляционного наркоза без предварительного введения других анестетиков. Пригодными для этих целей считают хлороформ и эфир. Животное помещают в эксикатор, через отверстие, в крышке которого дробными дозами подают наркотическое вещество. Установлено, что эфир лучше применять для умерщвления крыс, а хлороформ — кошек и птиц [Кисели Д., 1962].
Более крупным животным вначале вводят гексенал или тиопентал-натрий, а затем производят воздушную эмболию (морским свинкам в сердце, а кроликам в ушную вену). Для того чтобы было легче попасть иглой в сосуд, у кроликов предварительно выщипывают волосы с участка уха, а затем подготовленную область протирают ксилолом для усиления кровотока.
Самым крупным животным (собаки, свиньи, телята) вначале вводят миорелаксанты, а затем- анестетики. Если не нужно исследовать ткань мозга животного, то эвтаназию производят с помощью электрического тока — электроды вводят в область продолговатого мозга и крестца [Лоскутова З.Ф., 1980].
С целью получения материала для некоторых видов морфологического исследования (электронная микроскопия, иммуноцитохимия) у мелких животных применяют сочетание эвтаназии с прижизненной фиксацией органов и тканей.
Мелких лабораторных животных вскрывают на пробковых или пенопластовых пластинах, помещенных в кювету. Животных фиксируют, прикалывая кожу к пластинам с помощью препаровальных игл, или привязывают за лапки к крючкам в торцевой части пенопластовых пластин.
Для вскрытия кроликов и кошек используют покрытые пластиком деревянные станки. Крупных животных вскрывают на специальных металлических секционных столах.
Техника вскрытия всех лабораторных животных одинакова.
Особенностью ее является наличие у большинства из них выраженного шерстного покрова, поэтому во избежание попадания фрагментов волос на внутренние органы на коже предварительно выбривают участок, где будет произведен разрез. Затем нижнюю часть стенки живота приподнимают пинцетом по средней линии, прорезают ножницами (очищенными от волос) и разрезают брюшную стенку снизу вверх до грудины, стараясь не повредить внутренние органы. Вскрытие грудной полости производят двумя разрезами через реберные хрящи по обе стороны от грудины снизу вверх, костно-хрящевой лоскут удаляют.
В том случае, если по условиям эксперимента предполагается изучение одного или нескольких органов, вскрывают ту часть тела животного, где он (или они) располагается. Орган иссекают, вырезают кусочки необходимого размера и фиксируют в заранее выбранном для данного исследования фиксаторе.
При многоплановых токсикологических исследованиях, проводимых, как правило, на крысах и мышах и предполагающих выполнение серии экспериментов с большим количеством животных, к вскрытию необходимо привлекать самих экспериментаторов и хорошо обученных лаборантов, которые должны работать под руководством опытного морфолога.
На каждое животное необходимо оформить протокол вскрытия, в котором дают оценку состоянию внутренних органов, отмечают наличие интеркуррентных, не связанных с изучаемым веществом или воздействием, заболеваний. У животных как опытных, так и контрольных групп часто встречаются глистные инвазии, воспалительные или опухолевые поражения. Животных, у которых обнаружены подобные изменения, необходимо отбраковывать на этапе вскрытия или после сопоставления с результатами биохимических и других лабораторных исследований.
В некоторых экспериментах, таких как изучение нового лекарственного препарата, у подопытного животного (чаще всего крысы) извлекают около 20 органов, которые до фиксации необходимо взвесить. Порядок вскрытия при этом следующий: вначале выделяют тимус (лежит на трахее), затем — органы грудной полости; в брюшной полости первыми извлекают печень и селезенку, обнаруживают и выделяют надпочечники, почки и элементы мочеполовой системы; последними выделяют и промывают в изотоническом растворе хлорида натрия части желудочно-кишечного тракта.
Одновременно другой препаратор извлекает головной мозг: у крыс — кусачками, а у кроликов и собак с помощью пилы из секционного набора выпиливают достаточно крупный треугольник в лобной части черепа (после предварительного освобождения его от кожи), а затем с помощью анатомического пинцета и лопаточек мозг аккуратно извлекают, взвешивают и фиксируют.
Во избежание высыхания и быстро начинающихся изменений, особенно в железистой ткани, извлеченные органы перед взвешиванием накрывают марлевой салфеткой, хорошо смоченной изотоническим раствором хлорида натрия.
После взвешивания мелкие органы (надпочечники, лимфатические узлы) целиком и кусочки, вырезанные из более крупных органов, складывают в марлевую салфетку, помещают туда же бирку из фотобумаги, на не глянцевой поверхности которой мягким простым карандашом четко записывают номер животного или шифр. Мешочек завязывают таким образом, чтобы органы не слипались и располагались свободно, и опускают в банку с 10 % нейтральным формалином или другим фиксатором.
ПРОВОДКА И ЗАЛИВКА
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МАТЕРИАЛА
Тактика проводки и заливки экспериментального материала практически не отличается от таковой при обработке клинического (биопсийного) материала. После фиксации и промывания кусочки в случае необходимости подравнивают и уменьшают в размерах. В одних лабораториях предпочитают перед проводкой нанизывать кусочки на нитку, снабдив ее этикеткой, в других обезвоживание и пропитывание проводят в марлевых мешочках. Ниже приведена одна из апробированных схем проводки и заливки органов мышей и крыс.
Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине не менее 48 ч, после вырезки кусочков проводят их дофиксацию в течение 1 ч в термостате при 37 °С:
проточная вода 2 ч
70 % спирт 30 мин
96 % спирт 30 мин
100 % спирт I 1 ч
100 % спирт II 1 ч
хлороформ I 30 мин
хлороформ II 1 ч
хлороформ + парафин (1:1) при 56 °С 1ч
парафин I 56 °С 30 мин
парафин II 56 "С 30 мин
Продолжительность без фиксации 8 ч 30 мин
В том случае, если нет возможности за 1 рабочий день полностью провести и залить материал, рекомендуется довести проводку до смеси хлороформа с парафином и оставить в ней материал при комнатной температуре на ночь.
После фиксации материала в жидкости Карнуа (в течение 2 ч при 4 °С) кусочки помещают в 2 смены 100 % спирта на 30 мин в каждую, далее — по приведенной выше схеме.Общая продолжительность фиксации, проводки и заливки материала 7 ч.
При большом количестве экспериментального материала с целью экономии времени и материальных затрат на изготовление одного препарата можно заливать в один блок по 3 — 4 кусочка от одного животного с учетом плотности и особенностей ткани. Так, хорошо режутся залитые вместе почка, легкое и мозг; различные отделы желудочно-кишечного тракта; семенник, тимус и легкое; сердце, селезенка и печень. Не всегда получаются стандартно хорошие препараты печени, что может быть связано с различным кровенаполнением органа в зависимости от вида забоя животного. Необходимо следить за тем, чтобы кусочки печеночной ткани были хорошо фиксированы, и не допускать пересушивания материала при обезвоживании и пропитывании.
РЕКОМЕНДАЦИИ
ПРИ РАБОТЕ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ МАТЕРИАЛОМ
Во-первых, для каждого эксперимента необходим адекватный, хорошо продуманный и согласованный с морфологом контроль.
Чаще всего контролей несколько, в том числе интактные животные, содержащиеся в таких же условиях, как и опытные.
Во-вторых, если экспериментальная работа оказалась перспективной и ожидается получение важных, далеко идущих выводов, необходимо повторить эксперимент с учетом выраженных сезонных изменений, имеющихся у большинства лабораторных животных.
В-третьих, в экспериментальной лаборатории, кроме протоколов вскрытия животных, должна быть тетрадь учета поступающего материала по годам. В ней после фамилии экспериментатора фиксируют время поступления материала, его шифр или номер, особенности эксперимента, перечень органов и количество кусочков каждого органа с пометкой об особенностях их ориентирования при заливке. Кроме того, указывают способ фиксации и методы окрашивания препаратов. При длительном (иногда до 3 лет) эксперименте следует вносить в тетрадь данные о том, в каком виде остается архив и где он находится.
Архив нужно хранить как можно дольше, минимум 10 лет, так как иногда из незначительного, на первый взгляд, эксперимента в последующем вырастает новое научное направление. Кроме того, при испытании некоторых препаратов сначала не обнаруживают признаков токсического воздействия, а проявляются они лишь во втором и третьем поколениях животных. Примером может служить тератогенный эффект диэтилстильбэстрола — синтетического аналога синэстрола. В данном случае важным научным аргументом явились препараты первичного эксперимента, хранившиеся в лаборатории около 20 лет.
В-четвертых, необходимо знать, что морфологическое исследование является неотъемлемой составной частью любой экспериментально-клинической работы. При получении результатов, имеющих важное практическое, в том числе коммерческое, значение или являющихся предметом изобретения или открытия, морфолог — полноправный участник творческого коллектива — может использовать результаты эксперимента в собственной научной работе.
Микроскопическая техника. РУКОВОДСТВО Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова 1996г. Москва
| 
