Микроскопические измерения
Для проведения измерений и подсчета необходимы: объект-микрометр, окуляр-микрометр и препаратоводитель на столике микроскопа.
Объект-микрометр представляет собой металлическую или стеклянную пластинку в форме предметного стекла (рис.1а).
На этой пластинке обозначен круг, в центре которого имеется шкала. Величина всей шкалы составляет 1 мм. Она разделена на 100 частей (рис.1б). Интервалы между делениями обычно равны 0,01 мм, т.е. 10 микрометрам (сокращенное обозначение мкм) - это цена одного деления объект-микрометра. Эта величина всегда обозначена в виде маркировки на объект-микрометре. Объект-микрометр нужен для определения цены деления окуляр-микрометра, для определения масштаба изображения на микрофотографиях и рисунках и для определения увеличения микроскопов со сложными оптическими системами.
Окуляр-микрометр представляет собой тонкую круглую стеклянную (отдельную или вмонтированную в окуляр) пластинку, с нанесенной на ней линейной шкалой (рис.1в). Длина всей шкалы может равняться 5 мм. Она разделена на 50 частей, по 0,1 мм каждая, или же на 200 частей - по 0,05 мм каждая. Бывает шкала окуляр-микрометра длиной в 10 мм. Она разделена на 100 частей, по 0,1 мм каждая. Окуляр-микрометр вставляется между линзами окуляра. Такой окуляр-микрометр служит для линейных измерений.
Для измерений плоскостей и для подсчета числа клеток в определенной площади используется сетчатый окуляр-микрометр. В нем на стеклянной пластинке нанесен квадрат. Длина сторон квадрата 10 мм. Каждая сторона квадрата разделена на 20 частей. В результате пересечения горизонтальных и вертикальных линий образуется сеточка, с интервалами между делениями 0,5 мм (рис.1г).
Для измерения больших объектов и для повышения точности измерений используется винтовой окуляр-микрометр. Отсчетный механизм его состоит из шкалы (от 0 до 8 мм) с интервалами между делениями в 1 мм, нанесенной на неподвижной стеклянной пластинке, и сетки в виде двух рисок с перекрестием, нанесенной на подвижной стеклянной пластинке, а также микрометренного винта с отсчетным барабаном. Обе пластинки расположены в фокальной плоскости окуляра. Подвижная пластинка с рисками и перекрестием связана с микрометренным винтом так, что при его вращении перекрестие и риски перемещаются в поле зрения окуляра относительно неподвижной шкалы. Шаг винта равен 1 мм. Таким образом, при повороте барабана винта на один полный оборот, риски и перекрестие в поле зрения окуляра переместятся на одно деление шкалы. Следовательно, неподвижная шкала в поле зрения служит для отсчета полных оборотов барабана винта, т.е. для отсчета полных миллиметров, на которые перемещается перекрестие и риски окуляр-микрометра. Барабан винта разделен на 100 частей. При шаге винта в 1 мм поворот барабана на одно деление соответствует перемещению перекрестия и рисок на 0,01 мм. Таким образом, шкала барабана служит для отсчета сотых долей миллиметра.
Полный отсчет по шкалам окуляр-микрометра складывается из отсчета по неподвижной шкале и отсчета в поле зрения определяется положением перекрестия и рисок, т.е. подсчитывается, на сколько полных делений шкалы они переместились, считая от нулевого деления шкалы. При отсчете по барабану микрометренного винта, определяют, какое деление шкалы барабана приходится против индекса, расположенного на подвижной части винта. Пределы измерения винтовым окуляр-микрометром - от 0 до 8 мм.
1. Линейное измерение объектов.
Величина объектов измеряется единицами длины микрометрами (мкм), которые раньше назывались микронами.
Изображение объектов под микроскопом измеряется окуляр-микрометром в делениях его шкалы. Поворотом окуляра, в который вложен окуляр-микрометр, и перемещением препаратоводителя на столике микроскопа, совмещают шкалу окуляр-микрометра с измеряемым объектом по направлению измерения. Определяют сколько делений окуляр-микрометра приходится на длину (ширину) объекта. При работе с винтовым окуляр-микрометром, наблюдая в окуляр и вращая барабан по часовой стрелке, подводят центр перекрестия до совмещения с краем измеряемого объекта и делают первый отсчет по шкалам окуляр-микрометра по положению рисок.
По шкале в поле зрения отсчитывают полные мм, а по шкале барабана - сотые доли мм. Таким образом подводят перекрестие до совмещения его центра с изображением второго края измеряемого объекта и делают второй отсчет по шкалам микрометра. Вычисляют разность отсчетов, которая является величиной изображения объекта.
Например, первый отсчет по окуляр-микрометру равен 3,52 мм; второй отсчет равен 3,64 мм. Величина изображения объекта = 3,64 мм - 3,52 мм = 0,12 мм (120 мкм).
Для выяисления абсолютной величины объекта нужно определить цену деления окуляр-микрометра. Для этого на предметный столик микроскопа, вместо препарата помещают объект-микрометр, находит его шкалу и совмещают ее со шкалой окуляр-микрометра. Определяют сколько делений окуляр-микрометра приходится на какое-то определенное, возможно большее, число делений объект-микрометра.
Высчитывают цену деления окуляр-микрометра: L = (N x s)/ n, где
L- Цена деления окуляр-микрометра
N- Число делений объект-микрометра
S- Цена одного деления объект-микрометра (см. маркировку)
n- Число делений окуляр-микрометра, совпадающих с числом делений объект-микрометра
Пример: 40 делений окуляр-микрометра точно совпадают с 9 делениями объект-микрометра. Цена деления объект-микрометра равна 0,01 мм (10 мкм).
Расчитаем цену одного деления окуляр-микрометра: L = (9 х 0,01 мм)/40 = 0,00225 мм » 2 мкм.
Таким образом, цена деления окуляр-микрометра при данной комбинации окуляра и объектива равна двум мкм. Цена деления окуляр-микрометра зависит от комбинации окуляра и объектива, а также от длины тубуса микроскопа. Поэтому она определяется для каждого сочетания окуляра и объектива, применяемого для измерения, и записывается. При работе на одном микроскопе можно один раз определить цену деления окуляр-микрометра при различных комбинациях окуляров и объектвов и использовать полученные величины при последующих измерениях. При работе с объективами, у которых имеется коррекционное устройство на толщину покровного стекла, все сравнительные измерения проводят при одинаковом его значении.
Абсолютную величину объекта вычисляют, умножая величину изображения объекта, определенную в делениях окуляр-микрометра на цену деления окуляр-микрометра.
В нашем примере: абсолютная величина объекта = 120 мкм х 2 мкм= 240 мкм.
2. Определение увеличения (масштаба) изображения на микрофотографиях и рисунках.
Для определения увеличения микрофотографий фотографируют шкалу объект-микрометра при тех же комбинациях окуляра, объектива и увеличения фотонасадки, если их несколько, как у МФН-II, при которых проводилась съемка объекта. Негативы с указанием значения окуляра и объектива хранить в фототеке. При печати микроснимков при этом же увеличении фотоувеличителя печатают и фотографию шкалы объект-микрометра. На фотоотпечатке линейкой измеряют величину нескольких делений шкалы объект-микрометра или всю шкалу. Полученное число делят на абсолютную величину этого отрезка шкалы объект-микрометра (число делений объект-микрометра, умноженное на абсолютную величину одного деления объект-микрометра; абсолютную величину одного деления объект-микрометра определяют по маркировке на пластинке объект-микрометра). Это число и есть кратность увеличения изображения на микрофотографии. Для определения увеличения рисунка, проецируют на этот рисунок рисовальным аппаратом шкалу объект-микрометра (при той же оптике, при которой выполнялся рисунок) и зарисовывают часть шкалы объект-микрометра. Затем производят те же измерения и подсчеты, что и при определении увеличения на микрофотографиях.
Например, изображение семи делений объект-микрометра на рисунке или микрофотографии равны 18 мм. Абсолютная величина одного деления объект-микрометра (по маркировке на нем) равна 0,01 мм. Абсолютная величина семи делений объект-микрометра = 7 х 0,01 = 0,07 мм (70 мкм).
Увеличение изображения= 18 мм (18000 мкм)/ 0,07 мм (70 мкм) = 257
Можно на рисунках для печати изобразить небольшой отрезок шкалы объект-микрометра, с указанием абсолютной величины этого отрезка в мкм.
3. Определение абсолютной величины объекта по его рисунку.
При проецировании шкалы объект-микрометра на рисунок можно по изображению объекта на рисунке вычислить абсолютную величину объекта без измерения его окуляр-микрометром. Величина объекта на рисунке и величина отрезка шкалы объект-микрометра на рисунке измеряется линейкой.
S = (B x K) / b , где
S - Абсолютная величина объекта;
B - абсолютная величина отрезка шкалы (нескольких делений) объект-микрометра;
K - величина объекта на рисунке;
b - величина отрезка шкалы объект-микрометра (нескольких делений) на рисунке.
Пример: Величина изображения объекта на рисунке равна 62 мм. Произвольный отрезок спроецированной шкалы объект-микрометра на рисунке равен 22 мм и включает в себя 10 делений объект-микрометра. Абсолютная величина этого отрезка шкалы объект-микрометра равна числу делений в нем, умноженному на абсолютную величину одного деления (по маркировке на пластинке объект-микрометра), т.е. 10 х 0,01 мм = 0,1 мм.
Абсолютная величина объекта = (0,1 мм х 62 мм) / 22 мм = 0,282 мм = 282 мкм.
Все подсчеты проводятся в одних единицах измерения в мм, а конечный результат можно перевести в мкм (1 мм = 1000 мкм).
4. Определение "линейного увеличения" объектов.
Кроме абсолютной величины объектов, в цитологических исследованиях используется показатель "линейное увеличение" т.е. отношение величины изображенного на рисунке объекта к абсолютной величине объекта. Способы определения величины объекта на рисунке и абсолютной величины объекта описаны выше.
Если взять данные из предыдущего примера, где величина изображения объекта на рисунке равна 22 мм, а абсолютная его величина равна 0,282 мм, то линейное увеличение объекта = 22 мм / 0,282 мм = 78.
5. Измерение длины с помощью крестообразного столика (препаратоводителя) микроскопа [1].
Линейной мерой объекта в двух измерениях служит продольное и поперечное смещение столика относительно делений шкалы нониуса. При этом возможны точные змерения от 0,1 мм и приблизительные - до 0,05 мм. Для этого применяют окуляры с перекрестием или с указателем. Препаратоводитель смещают до совпадения точки измеряемого объекта, принятой за начало отсчета, с перекрестием и отмечают показания измерительной шкалы. Затем продольным или поперечным движением препаратоводителя достигают конечной точки отсчета и вновь отмечают показания. Разность показаний является линейной мерой исследуемого объекта.
6. Измерение длины с помощью счетной камеры [1].
В качестве вспомогательного приспособления для измерения длины можно применять камеру для подсчета элементов крови. Дно отсчетной камеры разделено на квадраты различной длины. Длина сторон наименьшего квадрата равна 0,05 мм, "Группового квадрата" - 0,2 мм и большого квадрата - 1 мм. Измеряемый объект помещают в счетную камеру и определяют его длину путем сравнения его с длиной сторон квадратов счетной камеры.
7. Пересчет количества структурных элементов (устьиц, волосков и др.) на единицу площади (1 кв.мм) органа, ткани.
Сначала необходимо вычислить площадь поля зрения микроскопа (при той же комбинации объектива и окуляров, при которой будет проводиться подсчет) по формуле
S = pr2 где:
S - площадь поля зрения микроскопа,
r - радиус поля зрения микроскопа,
p - 0,1416.
Диаметр поля зрения микроскопа (d) измеряется объект-микрометром, значение диаметра делится на 2 и получается значение радиуса для прведенной выше формулы. Зная цену деления объект-микрометра (см. маркировку на пластинке объект-микрометра), легко вычислить диаметр поля зрения микроскопа. Затем подсчитывают количество изучаемых структурных элементов в поле зрения микроскопа (при условии, что изучаемая ткань или орган занимают все поле зрения микроскопа):
A = W x (1 мм 2/S) , где
A - Количество изучаемых структурных элементов на единицу площади в 1 мм 2
W - Количество их в поле зрения микроскопа
S - Площадь поля зрения микроскопа (мм 2)
Отношение (1 мм 2 / S) является постоянным коэффициентом для данной оптики, на который можно умножить подсчитанное количество структурных элементов в поле зрения, не составляя каждый раз уравнения.
Пример:
d = 420 мкм = 0,42 мм;
r = 210 мкм = 0,21 мм;
r2 = 0,0441 кв.мм;
S = 3,1416 х 0,0441 = 0,138 мм 2
В поле зрения подсчитано 52 устьица. 52 устьица приходится на площадь 0,138 мм 2 . Х устьиц приходится на площадь 1 кв.мм:
Х = 52 х (1:0,138) = 52 х 7,25 = 373 устьица.
Таким образом, на площадь листа в 1 кв.мм приходится 373 устьица. 7,25 - постоянный коэффициент для данной оптики.
8. Измерение толщины объекта.
При измерении толщины пользуются микрометрическим винтом микроскопа. Сначала наводят на резкость верхнюю поверхность измеряемого объекта, а затем нижнюю. Отмечают разность в обоих положениях микровинта по делениям, которые на нем имеются. Эти деления обычно соответствуют микрометрам. При применении иммерсинных объективов эта величина равна толщине объекта; при объективах сухих систем ее надо умножить на 1,5, т.е. на соотношение между показателями преломления стекла и воздуха.
| 
