Общие методы заключения препаратов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ СРЕЗОВ
Парафиновые срезы, окрашенные жирорастворимыми красителями. Для выявления некоторых липидов, которые не вымываются из тканей при обезвоживании, просветлении, заливке, депарафинировании и перенесении в воду, срезы следует заключать в среды, в которых жиры и красители не растворяются. Для этого достаточно удалять избыточную иоду и заключить срезы в гумми-сироп, глихрогель, глицерин — желатин и т. я.
Заключение в смолы.
После просветления в ксилоле окрашенных обычными методами срезов их заключают чаще всего в смолы. Раньше в качестве сред для заключения использовали растворы канадского бальзама или даммаровой смолы, сгущенного кедрового масла, эупараля и др. в ксилоле и хлороформе. В канадский бальзам срезы заключают после окрашивания гематоксилином или эозином.
Для заключения срезов, окрашенных анилиновым синим и кислотным фуксином, Кертис предложил подкислить бальзам салициловой кислотой. Часть раствора бальзама в ксилоле разбавляют до консистенции жидкого сиропа, насыщают кристаллами салициловой кислоты, фильтруют через фильтровальную бумагу и смешивают с равным объемом исходного раствора. Если раствор пересыщен, в препаратах часто выступают кристаллы салициловой кислоты.
Все перечисленные выше смолы непригодны для заключения срезов, окрашенных по методу Романовского, так как синий компонент красителя в этой среде постепенно выцветает.
Заключение в смолы и сиропы осуществляют следующим образом. Подбирают покровные стекла соответствующих размеров, чтобы они закрывали срезы, в России приняты размеры 18X18, 20X20, 24X24, 24X36, 24X76 мм и др.
На покровное стекло по центру наносят каплю или, если стекло длинное, две капли жидкого раствора смолы в ксилоле. Покровное стекло помещают каплей вверх на фильтровальную бумагу. Если срезы заключают в растворы смол в ксилоле, одновременно можно подготовить до 6 покровных стекол, но для заключения замороженных срезов в сироп лучше готовить по одному стеклу. Предметное стекло с окрашенным срезом вынимают из ксилола или воды (в зависимости от проводки), подсушивают и держат его наклонно срезом вниз над покровным стеклом, так чтобы один его длинный конец касался фильтровальной бумаги рядом с покровным стеклом. Затем предметное стекло осторожно опускают, пока срез не коснется капли раствора смолы или сиропа на покровном стекле. Капля растекается к краям покровного стекла. Если под покровное стекло попадают пузырьки воздуха, их можно удалить, осторожно нажимая на покровное стекло кончиком препаровальной иглы или слегка приподнимая один его край; иногда достаточно просто добавить смолы или сиропа. Затем дают стечь избытку смолы, держа предметное стекло срезом вниз под углом около 30°, и, прижимая к нему покровное стекло, обсушивают его края фильтровальной бумагой. После этого препараты помещают на планшет и ставят в теплое место для сушки.
Края покровного стекла не следует вытирать ватой или марлей, смоченной ксилолом, так как при этом часть смолы может растечься по чистой поверхности покровного стекла. Засыхая, она образует неровности, которые мешают наблюдению под микроскопом и от которых очень трудно избавиться.
Если срезы заключают в трикапрат целлюлозы, то избыток его засыхает по краям покровного стекла в виде маленьких твердых шариков, которые легко срезать маленьким ножом или снять ногтем.
При заключении больших срезов для топографического изучения, например, молочной железы, больших полушарий мозга, костей человека и т. п. между срезом и покровным стеклом уже после заключения часто скапливается воздух. Во избежание этого рекомендуется использовать более концентрированные растворы смол, которые нагревают для уменьшения вязкости. Полистиролы не подходят для этой цели, так как их растворы имеют большую вязкость при сравнительно низких концентрациях.
Более удобны канадский бальзам, нейтральные эфирные смолы и некоторые цикло-парафиновые и терпеновые смолы; срезы можно заключать в слегка нагретые 60-80%-ные растворы этих веществ в ксилоле.
В результате неполного обезвоживания в окрашенных заключенных препаратах часто образуются непрозрачные или мутные зоны. Под микроскопом в таком участке среза и над ним обнаруживаются многочисленные мелкие капельки воды, окраска сильно выцветает. Чтобы избавиться от этого, снимают покровное стекло, смывают ксилолом синтетическую смолу или бальзам, обезвоживают срез в 100%-ном спирте, ацетоне или изопропиловом спирте, просветляют в смеси ксилола с обезвоживающим агентом и в 2-3 сменах свежего ксилола и вновь заключают.
Повторное окрашивание.
Если окраска обесцветилась, срезы можно окрасить вновь. Для этого препарат выдерживают в ксилоле (до нескольких часов, пока не отделится покровное стекло) и затем проводят через 100%-ный спирт и соответствующие растворы, как обычно.
Аналогичным образом поступают, если в распоряжении исследователя имеется только окрашенный срез, который было бы желательно окрасить по другому методу. В случае необходимости первичную окраску можно обесцветить подкисленным спиртом; срезы затем тщательно промывают водой и окрашивают по новому методу. Обычно срезы, окрашенные вначале железным гематоксилином, уже непригодны для проведения реакции с феррицианидом калия на железо, поскольку при этом будет реагировать также и железный лак.
Если на предметном стекле смонтированы два среза одного блока, я иногда окрашиваю заново только один срез, оставляя другой под покровным стеклом.
ЦЕЛЛОИДИНОВЫЕ СРЕЗЫ
Срезы из залитых в нитроцеллюлозу тканей можно приклеивать к предметным стеклам либо перед окрашиванием, либо после него. Срезы вылавливают из сосуда на чистое предметное стекло и расправляют; стекло при этом держат наклонно наполовину погруженным в воду, затем срез тщательно промокают фильтровальной бумагой.
Если срез еще не окрашен, его можно обработать парами эфира; при этом нитроцеллюлоза размягчится и плотно приклеится к предметному стеклу. Можно также опустить стекло на несколько секунд в 0,5%-ный раствор нитроцеллюлозы в смеси эфира со спиртом, насухо вытереть нижнюю поверхность предметного стекла и погрузить его для уплотнения пленки в хлороформ на 5-10 мин. Срезы затем последовательно проводят через 95 и 80%-ный спирты в воду (срезы тканей, фиксированных в жидкостях с сулемой, перед переносом в воду обрабатывают 0,5%-ным раствором йода в 70%-ном спирте 10—15 мин, а затем 5 %-ным раствором тиосульфата натрия 5-10 мин). Срезы можно перенести и непосредственно в раствор красителя, если он приготовлен на водном спирте. После окрашивания избыток красителя отмывают, как это принято для данного метода.
Целлоидин — один из видов нитроцеллюлозы, сложного эфира целлюлозы азотной кислоты. Лилли именует целлоидином продукт с относительно низким молярным весом, а нитроцеллюлозой — более вязкий продукт с большим молекулярным весом. В практике отечественных лабораторий принято пользоваться одним термином — целлоидин.
|
«Свободные» нитроцеллюлозные срезы.
Некоторые исследователи предпочитают окрашивать целлоидиновые и нитроцеллюлозные срезы до монтировки их на предметные стекла. Это особенно удобно при лабораторных занятиях, когда приходится готовить большое количество срезов с одного блока.
В этом случае из 80%-ного спирта, в котором хранятся срезы, их, переносят в спиртовые растворы красителей либо сразу, либо проводят предварительно через 70 и 50%-ный спирты и воду. Если надо удалить ртутный осадок, срезы проводят через 0,5%-ный раствор иода в 70%-ном спирте, раствор тиосульфата натрия и воду. Переносят срезы слегка изогнутым шпателем, придерживая, если необходимо, препаровальной иглой.
Обезвоживание и просветление нитроцеллюлозных срезов.
После окрашивания свободные срезы обезвоживают, просветляют, проводя последовательно через те же растворы, которые используются для нитроцеллюлозных срезов, наклеенных на предметные стекла. Последние обрабатывают так же, как и парафиновые срезы и целлоидинированные парафиновые срезы.
Срезы, окрашенные наиболее стойкими красителями, обезвоживают в 95%-ном спирте, просветляют в карбол-ксилоле Вейгерта [8], который представляет собой смесь, состоящую из одной части расплавленного кристаллического фенола и трех частей ксилола, промывают в 2-4 сменах ксилола и заключают в депекс, пермаунт, канадский бальзам или другую подходящую смолу, как и парафиновые срезы.
Обесцвечивание нитроцеллюлозы в срезах.
В случае необходимости окрашенную основными анилиновыми красителями нитроцеллюлозу можно обесцветить 2%-ным спиртовым раствором канифоли, затем обезводить срез и просветлить, как описано выше или по одному из методов, описываемых ниже.
Просветление срезов, окрашенных легко экстрагируемыми красителями.
Срезы, окрашенные основными анилиновыми красителями, которые экстрагируются карбол-ксилолом, Вейгерт [8] рекомендует просветлять в нескольких сменах ксилола; перед тем как переносить срезы в следующую смену растворителя, их подсушивают фильтровальной бумагой.
Многие авторы использовали для просветления различные эфирные масла, среди которых наилучшим оказалось оригановое масло. Срезы, окрашенные основными анилиновыми красителями, особенно смесями азуров с эозином, можно обезводить в 2 или 3 сменах 99%-ного изопропилового или 1,1-диметилэтанолом, которые не растворяют нитроцеллюлозу и не экстрагируют азур ни из срезов, ни из нитроцеллюлозы, а затем провести через смесь, состоящую из равных частей ксилола и спирта, и 2 смены ксилола. Срезы можно также дифференцировать в 2%-ном растворе канифоли (сосновая смола) в 95%-ном спирте, пока нитроцеллюлоза не обесцветится, затем обезводить и просветлить, проводя последовательно через изопропиловый спирт и ксилол, как описано выше. Наконец, можно чередовать осушивание и обработку ксилолом (2-3 смены), пока срезы не просветлятся.
ЗАМОРОЖЕННЫЕ СРЕЗЫ
Жировые красители.
Замороженные срезы, окрашенные для выявления жиров, вылавливают на чистые предметные стекла. Один край среза при этом удерживают на частично погруженном в воду стекле, которое затем осторожно вынимают, так чтобы срез распластался на поверхности стекла. Складки на срезе расправляют, вновь погружая его в воду. Иногда срезы расправляют с помощью препаровальных игл, особенно если они разорваны или имеют неправильную форму. Расправленный срез обсушивают, аккуратно промокая его гладкой фильтровальной бумагой. Затем срез заключают в подходящую среду, кал описано выше. Для заключения временных препаратов можно использовать глицерин. Препараты можно подготовить для более длительного хранения, тщательно подсушивая места соединения предметного и покровного стекол и окантовывая их раствором канадского бальзама в ксилоле или толуоле, а также нитроцеллюлозным клеем. Заключая срез в маленькую каплю глицерина, которая не доходят до крова покровного стекла, к окантовывая края полистиролом, можно получить довольно долго хранящиеся препараты.
Окантовка препаратов полистиролом.
Препараты, заключенные в глицерин-желатин или арлекс -желатин, окантовывают 20%-ным раствором полистирола в ксилоле, который наносят стеклянной палочкой по краям покровного стекла. Через 1 час препарат подсыхает и перестает прилипать, и его можно положить на следующее утро вместе с другими препаратами, не опасаясь, что они склеятся. Можно также попользовать для этой цели смесь ксилола и капрата целлюлозы.
Ланолиновая смола рекомендуется Ромейсом как наиболее подходящее средство для окантовки срезов, заключенных в водорастворимые среды. Для ее приготовления 20 г безводного ланолина сушат, нагревая при помешивании в фарфоровой чашке 15 или 20 мин. Затем, не прекращая перемешивания, постепенно добавляют 80 г канифоли, пока не образуется прозрачная светло-коричневая жидкость. Лучше нагревать ее на электрической плитке с закрытой спиралью, чтобы избежать воспламенения. Полученную смесь разливают в маленькие чашечки и оставляют для затвердевания. Стеклянную палочку или металлический шпатель сильно нагревают, отделяют с их помощью немного ланолиновой смолы и закрепляют ею углы покровного стекла. Затем края стекла окантовывают большим количеством горячей расплавленной смолы.
Для получения постоянных препаратов обычно используют среды, содержащие гуммиарабик или желатин. Гуммиарабик через некоторое время подсыхает до твердого состояния, а желатин перед использованием расплавляют. Состав нескольких успешно применяемых сред приведен в табл.
|
