Выделение ДНК из культуры клеток (высокосолевой метод)
Необходимые реагенты, материалы и оборудование:
EDTA; изопропанол; фосфатно-солевой буфер (ФСБ) 1х; хлорид Na (NaCl); 3M ацетат Na (pH 5,2); 10% додецилсульфат Na (SDS ); трис-EDTA (TE), pH 7.4; трис-HCl, pH 8.0; абсолютный этанол; Протеиназа К;
Пробирки типа Eppendorf;
Центрифуга типа Eppendorf 5815;
Термостат;
Вортекс
Таблица 2 - Приготовление растворов
Раствор
| Протеиназа К
| 100 mg
| Протеиназы К
| Трис EDTA, pH 7.4
| 10 ml
| Лизирующий
| Трис EDTA, pH 8.0
| 1 ml
| буфер
| NaCl, 5 M
| 8 ml
|
| EDTA, 0.5 M
| 0.4 ml
|
| Довести dH2O
| до100 ml
| 6 M хлорид Na
| Хлорид Na
| 3.5 g
|
| dH2O
| 10 ml
|
Протокол:
A. Лизис полученных клеток
1. Центрифугировать культивируемые клетки в течение 10 мин при 10 ° C (1200 об / мин).
2. Удалить супернатант и ресуспендировать осадок клеток два раза 1х PBS по 10 мл центрифугированием.
3. Ресуспендировать осадок в 10 мл буфера для лизиса ядер.
4. Центрифугировать осадок в течение 10 мин при 10 ° C (1200 об / мин). Удалить супернатант.
5. Добавить 3 мл буфера для лизиса ядер, ресуспендировать осадок.
6. Добавить 100 мкл протеиназы K (10 мг / мл) и 400 мкл 10% SDS. Слегка встряхнуть и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
B. Осаждение в соли высокой концентрации
7. К лизату добавить 1 мл 6 М NaCl.
8. Смешать энергично в течение 15 сек.
9. Центрифугировать при 3000 об / мин в течение 15 мин.
10.Перенести супернатант в новую пробирку и центрифугировать при 3000 об / мин в течение 15 мин.
11. Повторить шаги 9 и 10 пока пробирка не очиститься от соли (по крайней мере 3-4 раза).
C. Осаждение этанолом
12. Перенести супернатант в новую пробирку; измерить объем супернатанта.
13. Добавить 1 / 10 от общего объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 2.5-3 раза от общего объема холодного 100% изопропанола.
14. Слегка встряхнуть, пока ДНК не осядет.
15. Перенести ДНК в новую пробирку, содержащую 13 мл 70% этанол.
16. Перенести пробирки в вортекс и инвертировать в течение 2 часов, чтобы тщательно промыть.
17. Перенести ДНК в новую пробирку типа Эппендорф (1,5 мл) и центрифугировать в течение 30 мин при 14000 об / мин.
18.Высушить осадок в течение 5 мин.
19.Добавить 200 мкл dH20 и ресуспендировать при 37 ° С в течение ночи.
20. Измерить концентрацию ДНК и пустить 1-5 мкл (приблизительно 200нг) ДНК на гель-электрофорез в агарозном геле (1%) в 1х ТЕ буфере.
| 
