Выделение ДНК из клеток (фенольный метод)
Необходимые реагенты, материалы и оборудование:
Фосфатно-солевой буфер (ФСБ)-10х и 1х;
10% додецилсульфата натрия (SDS);
0,5 М ЭДТА;
хлороформ;
фенол;
изоамиловый спирт;
100% этанол;
3 М ацетат натрия ( рН 5,2);
1 М Трис-HCl (рН 8,0);
1х TE буфер (Tris ацетат / ЭДТА-№2);
дистиллированная вода;
протеиназа K.
пробирки типа Eppendorf;
центрифуга типа Eppendorf 5815;
термостат;
вортекс
Приготовление сахарозного буфера
Для приготовления 1 л сахарозного буфера брали: 109, 5 г сахарозы, 10 мл тритон Х-100, 5мл MgCl2 (1М), 10 мл Tris-HCl (1М pH 7,6), 1мл ZnSO4 1M, 0,4 мл EDTA 0,5М, 10 мл PMSF 0,1M и добавляли дистиллированную воду до 1 л. Хранят в холодильнике при +4°С.
Таблица 3 - Сахарозный буфер
Состав запасного раствора:
| на 1 л.
| Сахароза
| 109,5 г.
| Тритон x-100
| 10 мл.
| MgCl2 (0,2 M)
| 25 мл.
| Трис-HCl (1М, рH 7,6)
| 10мл.
| ZnSO4 x 7H2O (0,1M)
| 1мл.
| PMSF(0,1M)
| 10мл.
| EGTA(0,5M)
| 0,4мл.
|
Приготовление буфера для протеиназы К
Для приготовления 100 мл раствора брали: 1мл трис-HCl (1М, pH 10,5), 200 мкл 0,5 М Ш2-ЭДТА (pH 8,0), 15 мл NaCl (1М) доводили объем до 100 мл. Готовый раствор хранят в холодильнике при 4С.
Таблица 4 - Буфер для протеиназы К
| Таблица 5 - ДНК буфер
| Состав:
| на 1 л.
| Состав:
| на 1 л.
| 1M Трис-HCl (pH 10,5)
| 1мл
| 10 мМ Tris-HCl
(рН 7,4)
| 10 мл 1M Трис-HCl
| 0,5М ^2-ЭДТА
| 200 мкл
| 1 мМ EDTA
| 2 мл 0,5М Na2- ЭДТА
| 1M NaCl
| 15 мл
|
Протокол
В чистые полипропиленовые пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл вносили примерно 500 мкл суспензии лимфоцитов и 1 мл денатурирующего раствора холодного сахарозного буфера содержащего:
32M сахарозы, 5 мМ MgCl2, 0,01 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,1M ZnSO*7H2O,
2мM EDTA, 1мM PMSF, 1% тритон X-100 и держали 10 мин при комнатной температуре.
Добавление сахарозного буфера приводит к лизису эритроцитов и клеточной мембраны лимфоцитов, при этом ядерная мембрана остается интактной.
2.Образец центрифугировали при 3000 об/мин, при 4°С в течение 15 мин.
Сливали супернатант и ресуспензировали ядерный осадок в 400 мкл буфера для протеиназы К и добавляли 20 мкл 10% SDS до конечной концентрации 0,5%. При добавлении SDS происходит лизис ядерной мембраны, ДНК выходит из ядра, и можно визуально наблюдать увеличение вязкости раствора.
После 5 мин инкубации добавляли 5 мкл маточного раствора протеиназы К с концентрацией 20 мг/мл (конечная концентрация — 250 мкг/мл).
Инкубировали с протеиназой К в течение 12 ч при З7°С, либо — 3 ч при 55°С.
По окончании инкубации добавляли 400 мкл забуференного фенола (Sambrook et al., 1989), осторожно перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин.
После разделения фаз ДНК находится в верхней водной фазе, РНК — в фенольной фазе, белки — в интерфазе.
Верхнюю водную фазу перенесли в другую чистую пробирку и добавили 400 мкл смеси
фенол:хлороформ (1:1).
Перемешивали в течение 5 мин и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин.
Вторично верхнюю водную фазу перенесли в другую пробирку и добавили 400 мкл хлороформа.
Образец перемешивали в течение 5 мин и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин.
Третий раз верхнюю водную фазу перенесли в чистую пробирку, и к раствору ДНК добавили последовательно 40 мкл 3 М ацетата Na (1/10 объема) и 800 мкл охлажденного 96% этанола (2 объема).
Осторожно перемешивали, наблюдая преципитацию ДНК.
Образец центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин.
Промыли осадок 1 мл 70% этанола для удаления соли, используемой при переосаждении ДНК.
Образец повторно центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин.
Осадок высушивали при комнатной температуре до исчезновения запаха спирта и растворяли ДНК в ТЕ-буфере (в течение ночи).
Концентрация и чистота выделенной ДНК оцениваются при измерении оптической плотности (ОП) полученного раствора. Измеряют поглощение образца при 260 и 280 нм по сравнению с поглощением ТЕ-буфера. Для хорошо выделенного образца ДНК отношение ОП(260)/ ОП(280) должно быть не менее 1.8. Оптическая плотность раствора геномной ДНК с концентрацией 1 мг/мл соответствует ОП(260)=20 оптическим единицам (о.е.).
Образцы выделенной ДНК хранили в виде раствора в ТЕ-буфере при низкой температуре (—20°С).
| 
