Гель-электрофорез ДНК

Электрофорез в агарозном геле


Материалы

1. 10 х буфер трис-борат-ЭДТА (ТБЭ):

0,9 М основный трис,

0,9 М борная кислота,

20 мМ  ЭДТА.

рН доводят до 8,1—8,2 сухой борной кислотой

2. Агароза (для электрофореза)

3. Бромистый этидий EtBr: 10 мг/мл в стерильной дистиллированной воде

4. 6х буфер для нанесения: 0,25% бромфеноловый синий, 40% (в/о) сахароза в 1х ТБЭ


10xTBE-буфер ПРОПИСЬ:

10x, pH ~8.3;(храниться при NT в чистой посуде)


Состав

1x

10x

Молярность

1L

500ml

100ml

Tris base

89mM

0.89M

121.14g/M

107.8g

53.91g

10.78g

Boric acid

89mM

0.89M

61.83g/M

55.03g

27.51g

5.503g

EDTA, pH 8.0

2mM

20mM

500mM

40ml

43.84g

20ml

21.92g

4.0ml

4.38g

H2O



mQ

863.3ml

431.65ml

86.33ml


10x сток вполне устойчиво хранится при NT, если его профильтровать через 0.4µm фильтр.

Для PAAG используется как 1х, для агарозных - как 0.5х.  Для агарозных гелей имеет смысл применять при работе с маленькими (< 200bp) фрагментами. Считается, что клонирование из ТВЕ гелей сложнее, чем из ТАЕ.


50xTAE-буфер ПРОПИСЬ

Трис-ацетатный буфер, 1x pH = 7.6:

Tris-acetate 40mM

EDTA 1mM

хранить основной сток при 4oC, рабочее количество (~100ml) при NT





100ml

150ml

200ml

250ml

1000ml

Tris-base

2M

121.1g/M

24.22g

36.33g

48.44g

60.55g

242.2g

EDTA

0.05M

372.3g/M

1.862g

2.792g

3.723g

4.654g

18.615g

Укс. к-та

~1.56M

17.4M

~8.96ml

~9.40g

~13.44ml

~14.10g

~17.92ml

~18.80g

~22.40ml

~23.50g

~89.61ml

~94g

H2O


mQ

~73.30g

~109.95g

~146.60g

~183.25g

~733g

p(50x)=1.0878  удобно вначале растворить Tris и EDTA и лишь затем добавлять кислоту, следя за pH.



Методика

1. Готовят 1 х ТБЭ в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля.

2.Добавляют к 1 х ТБЭ агарозу в количестве, необходимом для получения 0,35—0,45% (в/о) раствора, и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.

3. Охлаждают смесь до +/- 50 °С.


За время охлаждения агарозы, заклеивают края УФ - проницаемой кюветы для геля автоклавированной липкой лентой.

4.Добавляют к раствору агарозы бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают, избегая появления в геле пузырьков воздуха.



5. Теплую агарозу выливают в кювету для геля и равномерно распределяют ее по кювете. Вертикально вставляют гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.


6. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин, затем осторожно удаляют гребенку и липкую ленту. Кювету с гелем помещают в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 х ТБЭ с бромистым этидием в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.


7. Подготавливают к электрофорезу образцы исследуемой и маркерной ДНК, для чего смешивают их с буфером для нанесения (5:1, о/о). Чтобы получить четкий сигнал при окрашивании бромистым этидием-EtBr, в лунку шириной 5 мм достаточно внести 200 нг маркерной ДНК. Для построения стандартной кривой необходимо использовать маркерные фрагменты, длина которых примерно равна длине исследуемой ДНК.


(EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.)

8. Осторожно вносят в лунки исследуемую и маркерную ДНК. для повышения точности определения размера маркерную ДНК наносят по обе стороны от исследуемой.



9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—3 В на 1 см геля в течение 1—3 ч.


10. Просматривают гель в УФ-свете на транс иллюминаторе и фотографируют .


Яндекс.Метрика