Выделение ДНК с использованием протеиназы К
Материалы
1.Протеиназа К
Растворяют лиофилизованную протеиназу К в стерильной дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл, разливают на аликвоты и хранят при —20 0С.
2.Насыщенный буфером фенол
В большинстве случаев фенол высокой степени чистоты можно использовать без дополнительной перегонки.
Расплавляют фенол при 65С в присутствии равного объема 0,5 М трис-НСI, рН 8,0, содержащего 0,2% 8-гидроксихинолин и 0,2% 2-меркаптоэтанол (2-МЭ). Когда фенол полностью расплавится, тщательно перемешивают смесь, отбирают водную фазу и дважды экстрагируют фенол 0,1 М трис-НСI, рН 8,0, содержащим 0,2% 2-МЭ. После последней экстракции водную фазу не удаляют, а оставляют ее в сосуде с фенолом. В таком виде насыщенный фенол может храниться при 4 °с до 1 мес
3. Смесь хлороформ: изоамиловый спирт (24:1, о/о)
4. Буфер ТЭ: 10 мМ трис-НСI, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0
Методика
1. Готовят образцы.
2. Добавляют к каждому образцу по 50 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и тщательно перемешивают.
3.добавляют к каждому образцу по 250 мкл раствора саркозила, тщательно и осторожно перемешивают.
4. Центрифугируют образцы при 3500 в течение 30 с.
5.Инкубируют образцы при 50 0С в течение 5 ч. Для удобства инкубацию можно проводить в течение ночи (до 16 ч).
6.добавляют к каждому образцу по 10 мл насыщенного буфером фенола, тщательно перемешивают до образования гомогенной эмульсии.
7. Продолжают экстракцию перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 мин.
8. Центрифугируют при 3500 в течение 1 мин.
9. Добавляют 10 мл смеси хлороформ: изоамиловый спирт и продолжают экстракцию в течение 5 мин.
10. Разделяют водную и органическую фазы центрифугированием при 3500 в течение 6 мин при комнатной температуре.
11. Переносят вязкую водную фазу в новую пробирку при помощи пипетки с широким отверстием и повторяют экстракцию смесью хлороформ: изоамиловый спирт один или два раза (пока интерфаза не станет чистой).
12.Добавляют к водной фазе два объема этанола, тщательно и осторожно перемешивают. Сразу после перемешивания образуется осадок ДНК.
13. Cобирают осадок ДНК центрифугированием при 3500 в течение 5 мин.
14. Отбирают супернатант и промывают ДНК 20 мл 70% спирта.
15. Промывают ДНК 1 мл 70% спирта и переносят ДНК в микроцентрифужную пробирку.
16.Осаждают ДНК центрифугированием при 3500 в течение 1 мин и отбирают супернатант.
17. Высушивают ДНК под вакуумом в течение 2,5 мин.
18. Растворяют ДНК в ТЭ до концентрации около 1 мг/мл
| 
