Метод получения колхицинированных
митозов у животных
Методика:
Колхицин 0,01% (Можно заменить коммерческим препаратом Винбластином) вводится внутрибрюшинно 1-граммовым шприцем - 0,2 мл, через 1,5 часа еще 0,2 мл, а через 1,5 часа мышь забивается корнцангом.
Отделяется бедренная кость (в местах выше суставов) и шприцем в центрифужную пробирку 1% цитратом натрия (C6H5O7Na3*H2O), подогретым до 37°С, вымывается костный мозг.
Пробирка ставится в термостат на 0,5 часа при температуре 37°С.
После инкубации проводится центрифугирование при 1000 оборотов/мин, в течение 3-х минут.
Фиксация:
Надосадочная жидкость сливается, и затем в оставшейся капле жидкости постукиванием разбивается осадок.
Фиксатор (метиловый спирт + ледяная уксусная кислота в отношении 3:1) наливаем по каплям в пробирку, одновременно разбивая осадок. Количество фиксатора доводится до 2 мл и оставляем на 12 мин. Пастеровской пипеткой вынимаем кусочки ткани и переносим в стаканчики.
Через 12 минут после добавления фиксатора проводят центрифугирование при 1000 об/мин - 3 минуты.
Также делают последующие три фиксации, т.е. наливается фиксатор, замечается время и спустя 12 минут суспензия центрифугируется при 1000 об/ мин - 3 минуты.
Общее время каждой фиксации 15 минут.
Время взвешивания стаканчиков входит во время фиксации.
Стаканчики обязательно уравновешивают перед каждым центрифугированием.
После 3-й фиксации надосадок сливается и осадок разбивается, затем добавляется фиксатора до 0,5 мл и из этой суспензии делается препарат. Для приготовления препаратов из пастеровской пипетки на холодное, мокрое, обезжиренное стекло наносятся капли взвешенной суспензии. Пипетку нужно держать на расстоянии примерно 10 см от стекла.
Затем над горелкой поджигается фиксатор и после того, как пламя на стекле пропадет, - т.е. спирт сгорит, подсушивают препарат.
Окрашивание препаратов.
Азур-эозин готовится: 0,1% эозин, 0,1% азур II на дистиллированной воде.
Смешивают непосредственно перед окрашиванием в пропорции: азур II - 6 частей,
Дистиллированная вода - 10 частей, эозин - 3 части.
Смесь наливают на стекла на полчаса-час, затем препараты промывают под струей водопроводной воды и оставляют подсушивать.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА ЛЯГУШКИ
1. Внутримышечно вводят 1 мл 0,5% раствора колхицина комнатной температуры на 18-20 часов - пальцы задних ног срезаются.
2. Лягушка обездвиживается и препарируются бедренные кости выше суставов.
3. Суставы срезаются, костный мозг шприцом вымывается гипотоническим 0,8% раствором (холодным) до 2 мл в центрифужную пробирку.
4. Гипотения 0,8% р-ром цитрата натрия (холодным) – 20 мин.
5. Центрифугирование 2000 об/мин ~ 5 мин.
6. Надосадочную жидкость слить,
7. Влить по стенке (осторожно!) фиксатор 3:1 на метиловом спирте. Фиксатор (метиловый спирт + ледяная уксусная кислота в отношении 3:1)
8. Фиксация без центрифугирования - 30 мин. - слить (2 мл фиксатора).
9. Фиксация без центрифугирования - 30 мин. - слить до 0,5 мл (1 мл).
10. Ресуспензировать осадок.
11. Пастеровской пипеткой суспензию наносят с высоты 15-20 см 1 каплю на обезжиренное холодное предметное стекло.
12. Препарат поджигается над спиртовкой до исчезновения пламени на поверхности стекла.
13. Препарат окрашивается свежеприготовленным 0,1% азур-эозином 2:1 - смесью заливается препарат на 20 мин.
14. Смыть краску проточной водой и подсушить на воздухе.
Ядра и хромосомы окрашиваются в фиолетово-синий цвет.
Краситель: на бидистилляте заранее готовятся:
1. эозин 0,1% р-р,
2. азур II 0,1% р-р; смешивают р-ры перед употреблением: 0,1% азур II - 2 части, 0,1% эозин - 1 часть.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС
Костный мозг из бедренной и большой берцовой, кости помещается в раствор, состоящий из 5 мл среды Мешковой-Северина и 0,1 мл 0,1% колхицина.
1. Инкубация 30 мин. при 37°С.
2. Центрифугирование при 1000 об/мин - 3 мин.
3. Слить надосадочную жидкость, добавить 2 мл 0,06 н KCI, нагретого до 37°С, ресуспензация, долить до 5 мл.
4. Термостат - 10 мин. при 37°С.
5. Центрифугирование при 1000 об/мин - 3 мин.
6. Слить надосадочную жидкость и налить 2 мл фиксатора (3:1) на 10 мин. в холодильник.
7. Ресуспензация, долить фиксатор до 5 мл - в холодильник на 20 мин. - I.
8. (повторить операцию пунктов: 5,6,7) - II
9. (повторить операцию пунктов: 5,6,7) - III
10. Центрифугирование при 1000 об/мин - 3 мин.
11. Слить надосадочную жидкость - 3 мл, остальное ресуспензировать .
12. Суспензию пастеровской пипеткой на холодное мокрое обезжиренное предметное стекло наносят с высоты 15-20 см -1 капля.
13. Препарат поджигается над спиртовкой до исчезновения пламени на поверхности препарата.
14. Препарат окрашивается свежеприготовленным азур-эозином 2:1 - смесь наливается на предметное стекло на 20 мин., затем смывается окраска под струей водопроводной воды и подсушивается на воздухе.
Ядра и хромосомы окрашиваются в фиолетово-синий цвет.
Среда Мешковой-Северина:
NaCl 0,9% - 100 мл
KCI 0,15% - 4 мл
СаCI2 0,11 м - 3 мл
MgS04 0,15 м – 1
Na2HPO4 0,1 м - 21 мл (Na2HPO4 нейтрализуется 0,1N р-ром HCI до pH 7,3).
Фиксатор:
1 ч. Ледяной уксусной кислоты, 3 ч, метилового спирта.
Краситель:
на бидистиллированной воде заранее готовятся
1. эозин 0,1% р-р,
2. азур II 0,1% р-р; смешивают их перед употреблением: 0,1% р-р азура II - 2 части, 0,1% р-р эозина - 1 часть.
МЕТОДИКА ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ОКРАШИВАНИЯ ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗА
Реактивы:
Краситель Романовского-Гимза (готовый)
Краситель "Гимза" - рабочий раствор, рн - 6,8-7,0. Растворяют матричный раствор красителя Романовского-Гимза в отношении 1:50 в фосфатном буфере при рН*- 6,0-6,5.
Буфер:
1/15 М КН2Р04 (9,078 г/л) - раствор А.
1/15-М Na2HPO4*2H2O (11,876 г/л) - раствор Б.
рН - 7,0- 61,0 мл раствора Б
| + Раствора А до 100 мл перед употреблением
| pН - 6,8- 50,0 мл раствора Б
| рH - 7,2- 72,0 мл раствора Б
|
Ва(0Н)2 насыщенный раствор при 20°С - 3-4 г на 100 мл бидистиллированной воды (небольшой осадок)
2 х SSC - 0,15 М NaCI (17,53 г/л) + 0,015 М цитрат натрия (8,72 г/л) в пропорции 1:1. рН 6,8-7,0.
Применяется
0.1 М NaOH
| для доведения рН
| 0,1 М Лимонной .к-ты
|
Процесс окраски
1. Фиксация материала в метиловом спирте 2-3 мин. или в уксуснокислом спирте в пропорции 3:1.
2. Готовят постоянные давленые препараты с разморозкой на сухом льду (45% уксусная кислота).
3. Высушивают давленые препараты.
4. Сухие препараты помещают на 3-5 мин. в насыщенный Ва(0Н)2.
5. Отмывка буфером.
6. Инкубирование препаратов 2xSS0 в течение 1 часа при рН - 6,8-7,0 при 60°С.
7. Водопроводная вода.
8. Окраска "Гимзой" 20-30 мин, при комнатной температуре
9. Промывка буфером - рН - 6,9»
10. Высушивание препарата на воздухе.
| 
