Микрометод культивирования лимфоцитов
цельной крови для хромосомного анализа
по Аракаки.
Принцип метода.
В культуре периферической крови с фитогемагглютинином (ФГА — очищенный митоген бобов) лимфоциты вступают в митотический цикл ежесуточно. Через 72 ч достигается максимальное число митозов. Добавленный в культуру колхицин останавливает митозы на стадии метафазы, наиболее пригодной для анализа. Затем производят обработку клеток гипотоническим раствором для набухания хромосом, фиксацию и приготовление препаратов на стеклах.
Оборудование и реактивы.
1. Питательная среда Игла (среда № 199).
2. Фитогемагглютинин (ФГА),
3. Колхицин (порошкообразный).
4. Гипотонический раствор -0,075М раствор хлорида калия или 0,44% раствор трехзамещенного цитрата натрия.
5. Ацетат спирта: 3 объема абсолютного спирта этилового или метилового, 1 объем ледяной уксусной кислоты.
6. Цельная сыворотка крупного рогатого скота.
7. Гепарин (патентованный раствор).
8. Краски азур и эозин.(Краситель Романовского)
9. Настольный бокс с бактерицидной лампой (ящик из стекла или плексигласа с отверстиями для рук, закрытыми резиновыми перчатками).
10. Холодильник.
11.Термостат на +37С
12. Центрифуга на 1000 оборотов.
13. Шприцы на 10,0 и 1,0 мл; иглы к ним, или вакутейнеры.
14. Автоматические пипетки или стеклянные микропипетки(стерильные).
15. Пастеровские пипетки.
16. Пипетки, градуированные на 1,0—10,0 и 20,0 мл.
17. Пробирки стерильные 10Х70 мм с резиновыми пробками (от пенициллиновых флаконов), закрепленными лейкопластырем.
18. Центрифужные пробирки.
19. Флаконы пенициллиновые с собственными пробками.
20. Резиновые баллоны для пипеток или тонкая резиновая трубка со стеклянным наконечником (для выдувания жидкости ртом).
21. Пробки резиновые (размер 10-12).
22. Предметные стекла.
23. Лейкопластырь.
Приготовление препаратов.
1. После тщательной очистки кожи пациента 70% спиртом из локтевой вены набирают 10 мл крови в стерильный шприц.
2. Кровь вводят в стерильную пробирку (заранее приготовленную в боксе и хранившуюся в холодильнике), содержащую 0,5 мг разведенного в 20 раз гепарина, через пробку, в которую дополнительно введена игла для прохождения воздуха. Приготовленная таким образом кровь может храниться в холодильнике до 3 дней.
3. В настольном боксе включают на 15 мин бактерицидную лампу. Культивирование проводят в боксе.
4. В стерильный пенициллиновый флакон стерильной пипеткой вводят 0,5 мл перемешанной гепаринизированной цельной крови.
5. Во флакон с ФГА вводят 5 мл стерильной бидистиллированной воды или 0,85% раствора NаС1 и хранят в морозильном отделении холодильника.
6. Стерильной микропипеткой вводят во флакон с кровью 0,015 мл ФГА. Стерильной пипеткой (на 10мл) вводят 5-6 мл среды Игла (среда№199) и такой же пипеткой вводят 1 мл сыворотки АВ(IV).
7. Флакон герметически закрывают стерильной пробкой № 10—12, энергично встряхивают и ставят в термостат при 37° на 72 ч, ежесуточно встряхивая в одно и то же время.
8. Через 72 ч в нестерильных условиях во флакон с культурой вводят 0,1мл раствора Колхицина (1 мг на 100 мл 0,85% раствора NаСI).
9. Через час содержимое флакона переносят в центрифужные пробирки, добавляют 5 мл нагретого до 37° 0,555% раствора хлорида калия на 5-8 мин при комнатной температуре.
10. Центрифугируют 8 мин при 1000 об/мин.
11. Удаляют над осадочную жидкость, на осадок медленно наслаивают 3-4 мл ацетата спирта.
12. Через 30 мин содержимое пробирки перемешивают, центрифугируют 8 мин при 1000 об/мин, удаляют часть надосадочной жидкости.
13. Если надосадочная жидкость бурая, фиксацию повторяют.
14. На предметные стекла, обезжиренные промыванием в хромпике и хранящиеся в холодильнике в 10 % водном растворе этилового спирта, накапывают с высоты 30 см суспензию клеток.
15. Предметные стекла проводят над пламенем спиртовой горелки (чтобы поджечь фиксатор).
16. Препараты окрашивают по Нохту или Романовскому и микроскопируют с иммерсионным объективом.
17. Со считывают число хромосом не менее чем в 50 метафазных пластинках, лучшие из них фотографируют.
| 
