2.2. Изучение морфологических изменений культур клеток
Диапазон токсичности ядохимикатов для культур клеток значительно уже, чем in vivo, и часто находится в пределах одного порядка. В связи с этим в опытах in vitro десятикратные интервалы между дозами не приемлемы. Для исследования дозовой зависимости эффекта оправдано использование следующего ряда доз: 1/2, 1/4, 1/8,ТД . 50
Морфологические, цитохимические исследования и особенно изучение митотического режима культур клеток следует проводить в динамике. Выбор точек фиксации может быть произвольным, однако с таким расчетом, чтобы они захватывали все этапы клеточного цикла, т.е. периоды G , S, G , и стадии 1 2 митоза. Для этого целесообразно фиксировать культуры через 3, 12, 24 и 48 часов после введения в среду пестицида. Для изучения вопросов элиминации или дупликации патологических форм деления нужно ввести дополнительные сроки фиксации (например, 72 и 96 часов от начала действия).В санитарно-токсикологическом эксперименте существенное значение имеет решение вопроса, обладает ли данное вещество свойством избирательно повреждать репродуктивный аппарат клеток. В связи с этим выбор длительности экспозиции не имеет существенного значения и контакт культуры с ядохимикатом может быть постоянным. При исследовании чувствительности отдельных периодов клеточного цикла продолжительность действия пестицида на культуру не должна превышать двух часов.
При постановке развернутого опыта нужно предварительно рассчитать необходимое количество флаконов с культурой, имея в виду, что для статистической обработки на каждую точку фиксации необходимо иметь не менее пяти опытных и контрольных препаратов.
Для фиксации культур клеток могут быть использованы метиловый спирт, смесь Буэна, 10-процентный нейтральный формалин, смесь Шабадаша и другие фиксаторы. Для унификации условий опытов необходимо применять один из них постоянно. Хорошие результаты дает фиксация в смеси Шабадаша (96° этиловый спирт - 100 мл, медь азотнокислая - 1,8 г, кальций азотнокислый - 0,9 г; ex tempore добавляют 10 мл 100-процентного нейтрального формалина) в течение 15 минут с последующей дофиксацией в 96° спирте. Подробные сведения по гистологической технике можно получить из руководства Г.А. Меркулова (1969) или из других подобных источников.
Фиксированные препараты окрашивают гематоксилином и эозином. При этом цитоплазма клеток не должна быть окрашена гематоксилином, а степень окрашивания ядер должна быть такой, чтобы четко были видны ядерные структуры. Заключают в бальзам на предметном стекле монослоем вниз.
Полученные препараты вначале изучают при малом увеличении микроскопа. Отмечают степень разрежения монослоя, характер роста (тяжистый, островковый), форму клеток, наличие зернистости или включений в цитоплазме, форму ядер, число ядрышек, характер распределения хроматина и др. Степень цитотоксичности пестицидов в определенной степени отражает индекс альтерации. Для его определения в каждом препарате подсчитывают при иммерсионном увеличении число дегенерирующих элементов на 1000 клеток. Результаты подсчета подвергают статистической обработке.
Следует отметить, однако, что индекс альтерации не отражает истинную степень цитотоксичности. Это связано с тем, что дегенерирующие под влиянием пестицидов клетки теряют адгезивные свойства, большинство из них отпадает от стекла и, следовательно, не может быть учтено при исследовании фиксированных препаратов.
2.3. Методы цитохимического исследования культур клеток
Проведение цитохимических исследований направлено, в первую очередь, на раскрытие механизма взаимодействия яда с клеткой, на поиск "точек приложения" вещества, в зависимости от его химического строения, интенсивности, длительности воздействия и т.д.
На культурах клеток в принципе можно поставить любую цитохимическую реакцию, методика которой разработана для гистологических срезов (Пирс, 1962; М. Берстон, 1965). Однако для этого нужно предварительно модифицировать основные условия опыта (подбор фиксирующей жидкости и установление оптимальных сроков фиксации, инкубации и т.д.) применительно к новому объекту исследования.
Результаты цитохимических исследований количественно могут быть оценены различными цитофотометрическими методами. При отсутствии необходимой аппаратуры удовлетворительные результаты дает полуколичественная визуальная оценка степени окрашивания или накопления гранул красителя в различных клеточных структурах с использованием балльной системы (от 1 до 3 баллов; см. В.В. Соколовский, 1971).
Для постановки цитохимических реакций культуры выращивают на покровных стеклах. Выбор доз и длительность экспозиции производятся с учетом данных обзорного морфологического исследования. Каждую реакцию необходимо проводить одновременно в контрольных и в опытных культурах.
Гликоген. Поскольку в клетках первично-трипсинизированных культур содержится мало гликогена,исследования целесообразно проводить на перевиваемых линиях.
Метод основан на окислении полисахаридов перйодатом калия или натрия с образованием свободных альдегидных групп, дающих в реакции с фуксинсернистой кислотой соединение красно-фиолетового цвета.
Для постановки реакции необходимо иметь заранее приготовленный реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота), перйодат калия или натрия, 1 н раствор соляной кислоты и бисульфит натрия (или метабисульфит калия) для сернистой воды.
Контрольные и опытные культуры фиксируют в смеси Шабадаша в течение 15 минут, затем ополаскивают 96° спиртом и дистиллированной водой. Культуры помещают в приготовленный 0,23 - 0,27 процентный раствор перйодата калия или натрия на 20 минут (в темноте), промывают в двух сменах дистиллированной воды, переносят в сернистую воду на 2 минуты, затем помещают в реактив Шиффа на 40 - 60 минут. Реакция проходит при комнатной температуре в темноте. Вновь промывают в трех сменах сернистой воды по три минуты в каждой, затем в двух сменах дистиллированной воды по 5 - 7 минут. Ядра докрашивают гематоксилином (см. выше), обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам. Гликоген выявляется в цитоплазме в виде глыбок красно-фиолетового цвета.
Выявление липидов позволяет обнаружить ранние признаки жировой дистрофии клеток. В токсикологическом эксперименте часто бывает достаточным выявление всех жиров и жироподобных веществ в клетке без дифференцировки их отдельных видов. Этим требованиям удовлетворяет окраска липидов Суданом III, IV или Суданом черным В, который обладает наиболее широким диапазоном окрашивания среди других судановых красителей. Для окрашивания липидов культуры ополаскивают в теплом растворе Хэнкса (37°), фиксируют в охлажденном 10 процентном нейтральном формалине 30 - 40 минут, после чего промывают водопроводной водой, помещают на 1 минуту в 70° спирт, затем в краситель на 20 минут; после окраски дифференцируют в 70° и 40° спиртах по несколько секунд в каждом, промывают в дистиллированной воде, докрашивают ядра клеток квасцовым кармином, снова промывают дистиллированной водой и заключают в глицерин-желатину. Результат: черно-синие гранулы липидов выявляются в цитоплазме клеток.
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) - митохондриальный фермент, осуществляющий окисление янтарной кислоты путем отщепления атомов водорода и их дальнейший транспорт. Гистохимическое выявление СДГ при действии токсических агентов отражает, с одной стороны, функциональное состояние митохондрий, с другой - позволяет судить о состоянии окислительно-восстановительных процессов, обеспечивающих клетку энергией.
Для выявления активности СДГ в качестве акцепторов водорода используют соли тетразолия. Восстанавливаясь, они образуют нерастворимый ярко окрашенный формазан, количество которого в клетках прямо пропорционально ферментативной активности СДГ.
Стеклышки с культурой ополаскивают в теплом растворе Хэнкса, укладывают монослоем вниз на предметное стекло, на которое предварительно нанесена инкубационная среда следующего состава: 20 мг неотетразолия, растворенного в 2 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,2 М раствора сукцината натрия и 2 мл фосфатного буфера (pH 7,6). Реакция должна проходить при минимальном доступе воздуха (в чашках Петри) при 37° - в течение 1 - 2 часов. Для прекращения реакции культуры ополаскивают 1-процентным раствором соляной кислоты, фиксируют в 10-процентном нейтральном формалине 15 - 20 минут, промывают водопроводной водой и заключают в глицерин-желатину.
Результат: в цитоплазме клеток видны синевато-фиолетовые гранулы формазана.
Фосфатазы являются гидролитическими ферментами, осуществляющими расщепление фосфорных эфиров. В зависимости от оптимума pH, при котором проявляется максимальная активность, фосфатазы делятся на кислые и щелочные. Кислая фосфатаза является одним из многочисленных ферментов лизосом; щелочная фосфатаза локализуется главным образом в микросомной фракции клеток.
Основой цитохимического выявления фосфатаз является их специфическое воздействие на соответствующий субстрат, содержащийся в инкубационной среде, и выпадение в результате этой реакции нерастворимого осадка. Принцип выявления щелочной фосфатазы методом азосочетания сводится к тому, что вследствие гидролиза ароматического эфира содержащимся в клетке ферментом освобождается ароматический радикал, который в ходе дальнейшей реакции образует нерастворимый азокраситель.
Щелочная фосфатаза. Культуры фиксируют в холодном 10-процентном нейтральном формалине 5 минут, хорошо промывают водой и помещают на 30 - 40 минут в инкубационную среду следующего состава: 0,1 М веронал-ацетатный буфер pH 9,2 - 20 мл, альфа-нафтилфосфат натрия - 20 мг, прочный красный TR - 20 мг. Среду готовят ex tempore, фильтруют непосредственно на стекло с культурой клеток. Реакция проходит при комнатной температуре. Для контроля среды одно стеклышко помещают в среду без альфа-нафтилфосфата натрия.
После инкубации культуры промывают водопроводной водой, ядра подкрашивают гематоксилином Майера 4 - 6 минут, препараты заключают в глицерин-желатину.
В местах активности фермента образуются мелкие темно-коричневого цвета гранулки, расположенные в основном в цитоплазме. В надъядерной зоне обнаруживаются лишь единичные гранулы. Наиболее высокая активность щелочной фосфатазы в клетках первичной культуры фибробластов эмбриона человека наблюдается на 4 - 5 день роста. Следует отметить высокую чувствительность фермента к действию некоторых пестицидов. В частности при воздействии на культуру медным купоросом активность фермента резко подавляется, в то время как севин существенно не влияет на его активность.
Кислая фосфатаза. Культуры фиксируют в холодном 10-процентном нейтральном формалине, время фиксации - 15 минут. Инкубируют в термостате при 37° в течение 40 - 60 минут в среде следующего состава: 0,1 М веронал-ацетатный буфер pH 4,8 - 5,0 - 20 мл, гранатовый прочный GBC - 20 мг. Дальнейшие процедуры реакции такие же, как для щелочной фосфатазы.
В местах активности фермента образуются темно-коричневые гранулы. Активность фермента в клетках культуры фибробластов эмбриона человека низкая, поэтому целесообразно проводить опыты на перевиваемых линиях.
Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) выполняют в клетке ряд важнейших функций, связанных с ростом и делением клеток, хранением и передачей генетической информации, синтезом белка, регуляцией деятельности клеточных ферментов и др.
Выявление ДНК. Наиболее специфичным и распространенным методом гистохимического выявления ДНК является реакция Фельгена, основанная на мягком кислотном гидролизе тканей. Освободившиеся при этом альдегидные группировки взаимодействуют с фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа) в результате чего ДНК окрашивается в пурпурный цвет.
Постановка реакции в культурах клеток сводится к следующему. Фиксированные в жидкости Шабадаша культуры ополаскивают в 96° спирте и в холодной воде и помещают на 1 минуту в 1 н раствор соляной кислоты при комнатной температуре. Подготовленные таким образом культуры помещают в химический стакан с 1 н раствором соляной кислоты на 9 - 10 минут в водяной бане при 60 °C. В течение этого времени температура должна поддерживаться на таком уровне. По истечении времени гидролиза стеклышки ополаскивают холодным 1 н раствором соляной кислоты, промывают в двух сменах дистиллированной воды и помещают в реактив Шиффа на 3 часа (в темноте), затем вновь промывают в двух сменах дистиллированной воды. Для большей четкости гистологической картины можно докрасить цитоплазму клеток 1-процентным водным раствором светового зеленого. Для этого краситель наносят непосредственно на препарат на 25 - 30 секунд, дифференцируют в 70° спирте, обезвоживают в 96° и 100° спиртах, проводят через толуол и заключают в бальзам.
Результат: ДНК, окрашенная в красно-фиолетовый цвет, локализована исключительно в ядрах. О ее состоянии судят по интенсивности окраски ядерного вещества и по количеству окрашенных структур.
Совместное выявление ДНК и РНК методом Браше. При окраске фиксированного материала в смеси метиловый зеленый - пиронин ДНК специфически окрашивается метиловым зеленым, а РНК ядрышка и цитоплазмы - пиронином.
Перед приготовлением смеси красителей метиловый зеленый должен быть очищен от содержащейся, как правило, примеси метилового фиолетового, препятствующего элективной окраске ядер. Для этого к 100 мл водного раствора метилового зеленого добавляют 100 мл хлороформа, интенсивно взбалтывают, дают отстояться, верхний водный раствор метилового зеленого сливают и используют для приготовления смеси красителей. Процедуру отмывания повторяют несколько раз.
Рабочий раствор метилового зеленого - пиронина состоит из равных частей растворов А и Б. Для приготовления раствора А соединяют 17,5 мл 5-процентного водного раствора пиронина G или Y, 10 мл 2-процентного водного раствора метилового зеленого и 250 мл дистиллированной воды. Раствор Б представляет собой ацетатный буфер с pH 4,8.
Фиксированные в смеси Шабадаша культуры промывают 96° спиртом и водопроводной водой и помещают в предварительно нагретую смесь красителей на 30 - 60 минут при комнатной температуре. Аккуратно промокают стеклышки фильтровальной бумагой, ополаскивают в изобутиловом спирте, проводят через 2 смены толуола и заключают в бальзам.
Результат: РНК - содержащие клеточные структуры окрашены в различные оттенки красного и розового цвета, ДНК ядер - в зеленый цвет.
Для установления специфичности окрашивания РНК необходима постановка контроля с обработкой одного стеклышка рибонуклеазой (или 5-процентным раствором трихлоруксусной кислоты). При этом РНК разрушается и в препарате не должны выявляться структуры, окрашенные в красный цвет.
2.4. Определение ДНК и РНК методом люминесцентной микроскопии
Изучение действия пестицидов на ДНК и РНК можно проводить с помощью метода люминесцентной микроскопии. Для этого клетки выращивают на стеклышках. Просмотр препаратов производится через 3, 24 и 48 часов после внесения изучаемых пестицидов. Стеклышки ополаскивают средой 199, фиксируют 5 - 10 минут в свежеприготовленной смеси спирт-уксусная кислота (3:1), затем проводят через спирты нисходящей концентрации (90°, 70°, 50°, 30°) по 3 - 5 секунд в каждом и промывают водопроводной водой. Препараты высушивают при комнатной температуре и окрашивают. Для этого стеклышки с фиксированными клетками первоначально помещают на 10 минут в фосфатный буферный раствор (pH 5,6), затем на 3 минуты в раствор акридинового оранжевого (1:1000) и трижды по 1 минуте промывают буферным раствором. Далее покровное стекло помещают слоем клеток вверх на предметное стекло, наносят каплю свежего буферного раствора, покрывают покровным стеклом и исследуют в люминесцентном микроскопе.
О степени изменений ДНК и РНК судят по цвету флуоресцирующих структур и равномерности распределения их в клетке. В норме для ДНК характерно зеленое свечение. При наличии изменений цвет меняется на светло-зеленый, желто-зеленый, желтый, РНК в цитоплазме контрольных культур светится красно-оранжевым или ярко-красным цветом. Под влиянием пестицидов свечение становится темно-красным, почти черным.
В норме распределение нуклеиновых кислот в клетках обычно равномерное. Под воздействием пестицидов в ядрах хроматиновая сеть становится разреженной, в них появляются мелкие или крупные гранулы зеленого цвета. Для РНК отсутствие свечения имеет место по периферии клетки, занимая 1/2 - 1/4 часть цитоплазмы.
Для количественной характеристики степени повреждения нуклеиновых кислот подсчитывают число измененных и неизмененных клеток в 10 полях зрения (как правило, всего 200 - 250 клеток), полученные данные пересчитывают на 100 клеток (проц.). Цитотоксичность регистрируют по описанной выше балльной системе.
3. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ПЕСТИЦИДОВ НА МИТОТИЧЕСКИЙ РЕЖИМ КУЛЬТУР КЛЕТОК
Сущность митоза как наиболее распространенного способа репродукции клеток заключается в равномерном распределении генетического материала между дочерними клетками.
В митотическом цикле клетки митоз занимает сравнительно небольшой отрезок времени, однако с точки зрения цитопатологии он представляет огромный интерес. Это связано с тем, что во время митоза появляются, по существу, все основные нарушения синтетических процессов, возникающие в интерфазе под влиянием химических и других экстремальных факторов. Следовательно, комплексное изучение митотического режима органов и тканей, а также культур эксплантированных клеток может дать ценную информацию не только о степени цитотоксичности ядохимикатов, но и о их влиянии на наследственные структуры клеток.
Процесс митоза принято разделять на 4 стадии: профазу, метафазу, анафазу и телофазу.
В ряде случаев для суждения о соотношении фаз митоза бывает достаточным определение коэффициента фаз, представляющего собой частное от деления суммы про- и метафаз на сумму ана- и телофаз.
3.2. Качественный и количественный анализ патологии митоза
Данные качественного и количественного анализа патологии митоза являются основными показателями состояния митотического режима культур клеток при действии пестицидов.
По современной классификации (И.А. Алов, 1965, 1976) патологические митозы подразделяются на три группы: I - патология митоза, связанная с повреждением хромосом (хромосомные и хроматидные мосты, отставания хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам, фрагментация и пульверизация хромосом, образование микроядер и др.); II - патология митоза, связанная с повреждением митотического аппарата (к-митозы, рассеивание хромосом в метакинезе, многополюсный митоз, трехгрупповая метафаза и др.); III - патология митоза, связанная с нарушением цитотомии. Изучение патологии митоза в объеме указанной классификации дает возможность судить о состоянии всего репродуктивного аппарата клеток, в том числе и хромосом как носителей генетической информации.
Ниже проводится краткое описание форм патологии митоза, наиболее часто наблюдаемых при действии пестицидов на культуру фибробластов эмбриона человека.
Отставание хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам. В основе нарушения движения хромосом лежит повреждение кинетохора или снижение его функциональной активности. В некоторых случаях отставание хромосом может быть обусловлено изменениями микротрубочек, связанных с кинетохорами. Исходом этой формы патологии может быть случайное попадание отставшей хромосомы в одно из дочерних ядер или ее элиминация. В некоторых случаях, особенно при множественных отставаниях, отставшие хромосомы формируют дополнительное микроядро. При любом исходе этот вид патологии приводит к формированию клеток с несбалансированным набором хромосом.
Фрагментация - один из основных видов повреждения хромосом при действии пестицидов. Фрагменты могут быть одиночными и множественными. Следует отметить, что не всегда возможно отличить хромосомный фрагмент от отставшей хромосомы, в связи с чем эти два вида патологии митоза можно учитывать совместно.
Судьба фрагментов хромосом различна. Они могут попасть в одно из дочерних ядер, элиминироваться из клетки или, случайно воссоединяясь, приводить к различным типам хромосомных аберраций (обменам, инверсиям, транслокациям).
Мосты являются следствием разрывов хромосом или хроматид с последующим воссоединением фрагментов, содержащих центромер. Образовавшаяся дицентрическая хромосома испытывает воздействие обоих митотических центров, растягивается между ними и образует мост. Мосты бывают одиночные и множественные, хромосомные и хроматидные. Кроме того, мосты могут образовываться вследствие слипания хромосом. Такие мосты отличаются тем, что в центре нити, формирующей мост, имеется четкое утолщение. В телофазе мосты довольно быстро рвутся, однако в следующем поколении клеток они могут вновь восстанавливаться.
Колхициновый митоз (к-митоз) - форма патологии, типичная для статмокинетических веществ. Развитие к-митоза связано с повреждением митотического аппарата клетки (микротрубочек) и сопровождается гиперспирализацией, а иногда и фрагментацией хромосом. Различают несколько видов к-метафаз. При обработке первичной культуры фибробластов эмбриона человека пестицидами наиболее часто встречается комковатая к-метафаза (хромосомы склеены в комковатое неправильной формы тельце). Эта форма патологии митоза обычно заканчивается пикнозом ядра и гибелью клетки. Реже наблюдаются метафазы с рассеянными по всей цитоплазме хромосомами. Такие формы, как "шар-метафаза", "звезда-метафаза", "псевдоанафаза" встречаются в единичных случаях. Исходом к-митоза является гибель клетки, реже - полиплоидизация или восстановление нормального течения митоза.
Трехгрупповая метафаза обусловлена повреждением кинетохоров либо дезорганизацией нитей веретена деления. При этой форме в клетке наряду с экваториальной пластинкой содержатся еще две дополнительные группы хромосом, расположенные у полюсов. Трехгрупповые метафазы приводят к анэуплоидии или к образованию многоядерной клетки.
Многополюсный митоз является следствием избыточной репродукции центриолей. При этом вместо двух образуются три или более дочерних клетки. Следствием этой формы патологии деления является образование клеток с анэуплоидными наборами хромосом.
Микроядра - это небольшие дополнительные образования, сформировавшиеся из отставших хромосом или их групп. При действии пестицидов микроядра наблюдаются в метафазе, анафазе и телофазе. По-видимому, такие клетки чаще всего погибают. Микроядра могут элиминироваться из клетки.
Остальные формы патологии (пульверизация хромосом, раннее разделение хроматид, моноцентрический и асимметрический митозы, неравномерная цитотомия и др.) при действии пестицидов встречаются очень редко и в процессе анализа могут быть объединены в группу "прочие формы патологии митоза".
При анализе патологических митозов встречаются погибающие делящиеся клетки, особенно при действии токсических доз пестицидов. Такие клетки обычно уменьшены в размерах, клеточная оболочка четко обозначена, образует выросты, цитоплазма клеток гомогенная, резко эозинофильная, митотические фигуры деформированы. Эти клетки трудно отнести к какому-либо виду патологии, их целесообразно учитывать отдельно как дегенерирующие митозы.
Регистрация патологических митозов осуществляется при иммерсионном увеличении микроскопа. Для этого в каждом препарате изучают 100 митотических фигур, и информацию о каждой делящейся клетке заносят в соответствующую графу регистрационного журнала, отмечая фазу деления и вид патологии, если она имеется. При этом удобно пользоваться клавишным счетчиком для подсчета форменных элементов крови. Ниже приведена форма регистрационной таблицы, которая может быть изменена в зависимости от индивидуальных особенностей патологии митоза при действии различных пестицидов.
Цифровые материалы обрабатывают общепринятыми методами статистической обработки (В.Ю. Урбах, 1964; Д. Сепетлиев, 1968).
| 
