Методы окраски тканей в гистологических исследованиях
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
Изоляция эпителиальных клеток и их окрашивание.
Изоляцию клеток лучше всего проводить в 30% спирте. Небольшие кусочки нефиксированного органа (например, трахеи) помещают в небольшой объем спирта (превышающий объем материала не более чем в 3 раза) и оставляют на 12—24 ч. После этого изоляция достигается уже при встряхивании или при легком поколачивании материала препаровальной иглой. Затем несколько капель мацерированной ткани размазывают препаровальной иглой по предметному стеклу, влажный мазок помещают на 20—30 мин в жидкость Буэна , далее в 50% спирт, дистиллированную воду, окрашивают гематоксилин -эозином или азур-2-эозином. Кусочек ткани после мацерации до выделения клеток можно тотально окрасить квасцовым кармином в течение 0,5—12 ч.
Приготовление красителя: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворяют 6 г хромовых квасцов, добавляют 1 г кармина, помешивают 15 мин, кипятят и после их охлаждения фильтруют.
После окрашивания следуют основательная промывка в дистиллированной воде, выделение клеток, обезвоживание, помещение в ксилол, бальзам.
Результат: ядра черно-синие, цитоплазма бледная сине-фиолетовая.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СОЕДИНИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
Приготовление пленочных препаратов рыхлой волокнистой соединительной ткани и окрашивание их железным гематоксилином по методу Ясвоина.
Приготовление растворов: 1. Раствор гематоксилина: 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, приливают 90 мл дистиллированной воды и оставляют до созревания (раствор должен приобрести красный цвет). 2. 6% раствор железоаммиачных квасцов. Непосредственно перед употреблением растворы смешивают на часовом стекле в таком отношении, чтобы осадок выпал не раньше чем через 0,5 мин, т. е. через срок, достаточный для окрашивания препарата. Если осадок выпадает через более длительный срок, препарат будет окрашен недостаточно контрастно. В среднем к 5 каплям квасцов прибавляют, встряхивая, 10—12 капель гематоксилина (добавляют гематоксилин в квасцы, а не наоборот).
Изготовление пленочных препаратов. Кожу вместе с подкожной соединительной тканью фиксируют в 10% нейтральном формалине (см. главу 21). Дальнейшую обработку можно проводить через несколько часов, а можно и отложить на 10—15 дней (не более, так как, если материал перестанет быть бархатистым, а станет жестковатым, он уже не годится для дальнейшей обработки). Из находящейся на поверхности стекловидно-прозрачной соединительной ткани острыми ножницами вырезают узкую полоску, помещают ее на предметное стекло, смазанное белком с глицерином и приступают к ее растягиванию двумя препаровальными иглами. Полоске надо дать слегка подсохнуть. Если она будет слишком влажной, она будет не растягиваться, а перемещаться по стеклу из стороны в сторону, если слишком высохнет, вообще не будет растягиваться. В результате растягивания должна получиться тонкая пленка. Не давая пленке окончательно высохнуть, ее помещают на 5 мин в 96% спирт. Затем предметное стекло с прилипшей к нему пленкой помещают в 70% спирт и, наконец, в дистиллированную воду на 5-10 мин.
Методика окрашивания.
Приготовленный краситель, на несколько секунд наливают на препарат. Когда выпадает осадок, препарат поливают большим количеством водопроводной воды, промывание продолжают в течение 15—30 мин. Сливать краситель с препарата нельзя, иначе осадок плотно пристанет к ткани.
Окрашивание эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта.
Приготовление растворов:
1. Раствор резорцин - фуксина (фуксилина).
В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г основного фуксина и 4 г резорцина, доводя до кипения, и прибавляют 25 мл официального раствора полуторахлористого железа (официальный раствор полуторахлористого железа представляет собой 50% раствор водного хлорного железа(III). — FeСI3*6Н2О). Раствор кипятят в течение 5 мин, все время помешивая, охлаждают и фильтруют. Фильтрат вынимают, а фильтр с образовавшимся на нем осадком после высыхания снимают с воронки, кладут в чашку, в которой кипятили смесь, заливают 200 мл 96% спирта и осторожно в водяной или песочной бане доводят до кипения. С фильтра остатки краски соскабливают в спирт, а фильтр выбрасывают. Спиртовой раствор краски охлаждают, фильтруют, доливают до 200 мл 96% спиртом и прибавляют 4 мл концентрированной хлороводородной кислоты (плотность 1,16— 1,19). Раствор хранится 1,5—2 мес.
2. Раствор литиевого кармина Орта. К 100 мл насыщенного раствора карбоната лития (при 20°С это 1,52% раствор) добавляют 2,5 г кармина, кипятят 5—1О мин, охлаждают и фильтруют.
Методика окрашивания
1) срезы (замороженные, целлоидиновые или депарафинированные парафиновые) окрашивают в литиевом кармине 10—15 мин;
2) не ополаскивая срезов, переносят их в 1% раствор хлористоводородной кислоты на 70% спирте на 5—10 мин и более. Этот раствор фиксирует кармин в ядрах и одновременно дифференцирует, извлекая его из других структур;
3) промывают срезы в водопроводной воде и 70% спирте;
4) переносят в резорцин - фуксин на 20-30 мил;
5) ополаскивают в дистиллированной воде 1-2 мин;
6) дифференцируют в 1% спиртовом растворе хлористоводородной кислоты (или в чистом 96%) под контролем микроскопа до тех пор, пока не выступит отчетливо эластическая сеть (примерно 3-5 мин); 6) обезвоживают, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Результат: ядра клеток красные, эластические волокна темно-синие.
Окрашивание эластических волокон резорцин - фуксином можно сочетать с окрашиванием по методу Ван-Гизона для чего срезы сначала окрашивают резорцин-фуксином, ополаскивают в воде, дифференцируют спиртовым раствором хлористоводородной кислоты и переносят в воду, а затем окрашивают по Ван-Гизону.
Выявление тучных клеток 0,1% раствором толуидинового синего в 30% спирте 1-2 мин.
Краситель хорошего качества при этом дает красивую красно-фиолетовую окраску тучных клеток. Можно растворять толуидиновый синий в воде или в буферных растворах при низких значениях рН
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ
Окрашявание железным гематоксилином по Гейденгайну.
Сначала производят окрашивание железным гематоксилином по Гейденгайну , затем срезы скелетной или сердечной мышечной ткани можно докрасить 0,5% водным раствором тиазинового красного, далее осуществляются их ополаскивание дистиллированной водой, обезвоживание, заключение в ксилол, бальзам.
Результат окрашивания: миофибриллы темно-синие, соединительная ткань и сарколемма интенсивно-красные, вставочные диски и хроматин черные.
Изоляция гладких миоцитов.
Маленькие кусочки гладкой мышечной ткани помещают в 33% раствор КОН. Через 1-2 ч в этом же растворе их разделяют препаровальными иглами на мелкие фрагменты. При удачной мацерации эти фрагменты распадаются на отдельные веретеновидные клетки уже от давления покровного стекла.
Окрашивание гладкой мышечной ткани на срезах ализариновым синим по Нейберту.
Приготовление растворов.
1. Раствор ализаринового синего: к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 10 г химически чистого сульфата алюминия и 0,5 г кислотного ализаринового синего, кипятят 5—10 мин, затем доливают до 100 мл дистиллированной водой и фильтруют.
2. Водный раствор ацетата меди (2,5% или иной — концентрацию раствора и время пребывания в нем подбирают опытным путем).
3. 5% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Методика окрашивания:
1) срезы из дистиллированной воды переносят на 3-5 мин в раствор ализаринового синего, который в зависимости от плотности препарата в большей или меньшей степени разводят дистиллированной водой;
2) дифференцируют и протравливают срезы в 5% фосфорно-вольфрамовой кислоте;
3) ополаскивают в дистиллированной воде;
4) помещают на 5-30 мин в раствор ацетата меди (в зависимости от концентрации раствора и толщины срезов;
4) промывают в водопроводной воде;
5) обезвоживают, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Результат: гладкая мышечная ткань окрашивается в синий цвет.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ И СЕРДЦА
Комбинированный метод окраски, рекомендованный Ромейсом.
Приготовление растворов.
1.Раствор резорцин - фуксина.
Раствор А: 0,5 г основного фуксина и 1 г резорцина растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор Б: 2 г кристаллического хлорида железа растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Раствор А нагревают до кипения в колбе объемом 200 мл, прибавляют раствор Б и на малом пламени кипятят еще 5 мин при помешивании. После охлаждения до комнатной температуры осадок собирают на маленький фильтр, затем вместе с фильтром помещают в колбу, заливают 70—100 мл 96% спирта и доводят до кипения. При этом осадок переходит в раствор. Остудив, прибавляют 0,7 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и фильтруют. Раствор годен в течение нескольких месяцев.
2. Железный гематоксилин Вейгерта.
Раствор А: 1 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта. Раствор Б: Официальный раствор полутора хлористого железа (50% раствор водного хлорного железа), 1 мл крепкой хлористоводородной кислоты и 95 мл воды.
Растворы А и Б хранятся месяцами. Непосредственно перед употреблением соединяют равные количества растворов А и Б. Смесь может храниться 8 дней.
3. Раствор азофлоксина: азофлоксина 0,5 г, дистиллированной воды 100 мл, ледяной уксусной кислоты 0,2 мл. (Вместо азофлоксина: ксилидинового пунцового 0,2 г, кислого фуксина 0,1 г, дистиллированной воды 300 мл, ледяной уксусной кислоты 0,6 мл.)
4. Фосфорно-молибденовая кислота - оранжевый: фосфорномолибденовой (или фосфорно-вольфрамовой) кислоты 3-5 г, дистиллированной воды 100 мл, оранжевого 0,2 г. 5. 1% раствор уксусной кислоты.
6. 1% водный раствор светлого зеленого.
Методика окрашивания:
1) препараты из 80% спирта помещают на 15 мин в резорцин-фуксин;
2) ополаскивают водопроводной и дистиллированной водой;
3) окрашивают ядра железным гематоксилином Вейгерта 2—3 мин;
4) ополаскивают дистиллированной водой, затем промывают в проточной воде 10 мин;
5) окрашивают азофлоксином (или пундовым кислым фуксином) 5 мин;
6) ополаскивают в 1% уксусной кислоте;
7) дифференцируют в фосфорно-молибденовой кислоте — оранжевом до обесцвечивания коллагеновых волокон;
8) быстро ополаскивают в 1% уксусной кислоте;
9) подкрашивают светлым зеленым 5 мин;
10) промывают в 1% уксусной кислоте 5 мин;
11) переносят в абсолютный спирт (3 порции), ксилол, бальзам.
Результат:
ядра черные, цитоплазма красная, коллагеновые волокна зеленые, эластические -черные, миоциты красные.
Окрашивание артерий эластического типа орсеином.
Приготовление раствора:
1 г орсеина растворяют в 100 мл 70% спирта и добавляют 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты.
Методика окрашивания:
1) парафиновые срезы без наклейки и депарафинирования пускают плавать на поверхности красителя в течение 30-60 мин, после чего подхватывают на предметное стекло;
2) быстро ополаскивают в дистиллированной воде и 96% спирте;
3) дифференцируют в 100% спирте до почти полного исчезновения фона;
4) просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Результат:
эластические волокна и мембраны окрашены в красно-коричневый цвет. Все остальное почти бесцветно. После фиксации в жидкости Буэна ядра остаются окрашенными в красивый фиолетовый цвет.
Выявление волокон Пуркинье окраской гликогена кармином по методу Беста.
Проводящие миоциты сердца богаты гликогеном, поэтому хорошо выявляются кармином по методу Беста.
Приготовление растворов.
1.Основной раствор кармина Беста: 2 г кармина, 1 г карбоната калия и 5 г хлорида калия растворяют 60 мл дистиллированной воды и кипятят на малом пламени в течение нескольких минут (осторожно, сильно пенится!). После охлаждения прибавляют 20 мл аммиака. Раствор сразу годен к употреблению. В темноте и в хорошо закупоренном сосуде хранится 1—2 мес. Перед употреблением раствор следует профильтровать.
2. Перед употреблением готовят рабочий раствор: основного раствора кармина Беста 20 мл, аммиака 30 мл, метилового спирта 30 мл.
3. Смесь для дифференцировки: метилового спирта 40 мл, абсолютного спирта 80 мл, дистиллированной воды 100 мл.
Методика окрашивания.
Материал фиксируют в жидкости Карнуа, спирт - формалине (1 часть формалина, 3 части 80% спирта) или другом фиксаторе, не содержащем воды, в которой гликоген растворяется. Заливка более пригодна целлоидиновая, так как целлоидин делает гликоген нерастворимым. После этого:
1) интенсивно окрашивают ядра гематоксилином Эрлиха;
2) основательно промывают;
3) окрашивают в рабочем растворе кармина Беста 5-20 мин;
4) переносят в дифференцирующую смесь метилового и абсолютного спирта с дистиллированной водой (срок дифференцировки от нескольких секунд до нескольких минут, пока не перестанут отходить облачка краски -2 порции жидкости);
5) ополаскивают 80% спиртом, обезвоживают, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Результат: гликоген интенсивно-красный, ядра синие.
Благодаря обилию гликогена проводящие миоциты сердца отчетливо выделяются. Если необходима количественная оценка содержания гликогена, вместо окраски кармином по Бесту следует использовать ШИК-реакцию.
Для получения обзорных препаратов сердца и сосудов подходит любая методика, в частности окрашивание гематоксилин - эозином.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОРГАНОВ КРОВЕТВОРЕНИЯ И ИММУНОПОЭЗА
Выявление железа в селезенке по Тирману и Шмельцеру.
Приготовление растворов.
1.10%раствор сульфита аммония. Раствор должен иметь желтый цвет. Хранится не более 3 нед.
2. Раствор красителя. Смешивают в равных количествах 20% раствор железосинеродистого калия и 1% раствор хлористоводородной кислоты.
3. Раствор ядерного прочного красного. 0,1 г ядерного прочного красного растворяют в 100 мл горячего 5% раствора сульфата алюминия. После охлаждения раствор фильтруют.
Методика окрашивания:
1) срезы из дистиллированной воды переносят в 10% раствор сульфита аммония на 1-24 ч,
2) ополаскивают дистиллированной водой
3) переносят на 10—20 мин в свежеприготовленный раствор красителя,
4) тщательно ополаскивают дистиллированной водой,
5) ядра окрашивают 5-10 мин в ядерном прочном красном,
6) промывают в дистиллированной воде,
7) обезвоживают и заключают в бальзам.
Результат: ядра красные, железо синее.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЫХАТЕЛЬНОГО АППАРАТА
Для фиксации дыхательного аппарата применяются жидкость Буэна, Ценкера и другие фиксаторы. Фиксировать легкие лучше всего путём перфузии фиксатора через сосуды, Для предотвращения спадания альвеол трахею нужно предварительно перевязать. Худшие результаты дает наполнение легкого фиксирующей жидкостью через канюлю, введенную в трахею. Это лучше делать до вскрытия грудной клетки (чтобы не спались альвеолы). Для того чтобы вытеснить воздух, фиксирующую жидкость нужно несколько раз вводить и вновь отсасывать. Если фиксируют кусочки легкого, помещая их в фиксатор, их следует покрыть сверху ватой, так как иначе они всплывут, и верхняя часть кусочка останется незафиксированной.
Для получения обзорных препаратов срезы лучше ориентировать перпендикулярно к поверхности органа. Для окрашивания препаратов подходит гематоксилин-эозин , азан . Эластические элементы выявляют с помощью орсеина или резорцин-фуксина . Железы и бокаловидные клетки воздухоносных путей хорошо окрашиваются муцикармином .
Окрашивание железным гематоксилином с последующим до окрашиванием по оригинальному методу Маллори.
Приготовление растворов.
1. Анилиновый синий - оранжевый G-кислый фуксин по Маллори. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г анилинового синего, 2 г оранжевого G и 2 г щавелевой кислоты. Раствор кипятят, остужают и фильтруют. Раствор хранится длительное время.
2. 0,1% водный раствор кислого фуксина.
3. 1% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Методика окрашивания:
1) материал окрашивают железным гематоксилином
2) помещают в 1% раствор кислого фуксина на 3 мин;
3) быстро промывают в дистиллированной воде и фиксируют окраску в 1% фосфорно-вольфрамовой кислоте 3—5 мин;
4) ополаскивают в воде и окрашивают в течение 2 мин в растворе анилиновый синий -оранжевый G- кислый фуксин;
5) ополаскивают и дифференцируют в 96% спирте, пока синими станут только коллагеновые волокна;
6) проводят через абсолютный спирт, ксилол, заключают в бальзам.
Результат:клетки эпителия альвеол окрашиваются в красноватый цвет и хорошо выделяются на синем фоне соединительно-тканных перегородок, слизь становится голубого цвета, эритроциты — оранжевыми, мышечная ткань желтой.
Метод хорошо удается при использовании сулемовых фиксаторов. Если материал был зафиксирован другим методом, можно перед окрашиванием обработать срезы жидкостью Ценкера в течение 15-60 мин.
| 
