Кровь: методы окраски

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ОКРАСКИ

При самых различных заболеваниях кроветворного аппарата (лейкозы, анемии, новообразования и пр.), как правило, приходится прибегать к окраске азур-эозиновыми смесями; из них наиболее часто в патологогистологической практике применяются краска Романовского-Гимза и азур II-эозин. Оба красителя по своему составу весьма сходны и процедура окрашивания ими одинакова. Для достижения хороших результатов основным и решающим моментом является свежесть материала. Погибшие или убитые экспериментальные животные должны быть вскрыты немедленно, а трупы умерших людей — по возможности не позднее 3—6 часов после смерти. Кроме того, следует строго соблюдать и целый ряд других условий:

1.Фиксация кусочков в ценкер-формоле; допускается и жидкость Орта  как вполне полноценный в данном случае фиксатор.

Можно получать неплохие результаты и после формалиновой фиксации, но при условии хромирования срезов и притом лучше в комбинации с сулемой. Декальцинированные объекты мало пригодны для гематологических исследований.

2.Срезы готовят максимально тонкие (5 мкм) и лучше всего парафиновые.

3. Для разведения красителей и промывания препаратов (срезов и мазков) берут свежую дистиллированную воду, сохраняемую под натронной известью. В день работы требуемое количество дистиллированной воды следует прокипятить в течение 3—5 минут, охладить и плотно закрыть. Оптимальный pH воды для гематологических окрасок — 6,8—7,0.

4.Посуда для красителей и дистиллированной воды должна быть безукоризненно чистой.

5.Красящие растворы готовят перед самым употреблением, нельзя допускать даже самого непродолжительного стояния их. Как во время приготовления красящего раствора, так и в момент выливания его на срезы не должно быть выпадения осадков. Образование осадков делает краску негодной и зависит либо от качества ее (что особенно надо иметь в виду в отношении краски Романовского—Гимза), либо от дистиллированной воды и, наконец, от посуды.

Приготовленную красящую смесь нельзя лишний раз взбалтывать, не допускается даже передвигать посуду, в которой идет окрашивание; и то и другое способствует преждевременному выпадению красителя.

6.Окрашивание проводят в чашках Петри на стеклянных палочках или на обломках спичек срезами вниз. Можно окрашивать и в стаканчиках.

7.Во избежание преждевременного выцветания препаратов употребляют ксилол хорошего качества (не содержащий кислоты). Из различных сортов ксилола здесь может быть рекомендован орто-ксилол, как наиболее очищенный. По своей цене он значительно дороже обычного «чистого» кислола, представляющего собой смесь трех изомеров (мета, орто, пара) с преимущественным содержанием м-ксилола.

8.Учитывая необходимость исследования с иммерсионной системой, пользуются тонкими покровными стеклами, не толще 0,17 мм.

ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ - ГИМЗА

Методика окраски. 1. Если материал был фиксирован в ценкер-формоле и осадки не были своевременно удалены в кусочках , то наклеенные на стекла срезы (депарафинированные) вначале освобождают от сулемовых осадков  и после этого хорошо промывают в дистиллированной воде. Препараты помещают в чашки Петри или в стаканчики.

2. Готовят красящий раствор в градуированном цилиндре, примерно из расчета 1—2—3 капли краски Романовского—Гимза на 1 мл дистиллированной воды г. Цилиндр один раз переворачивают для размешивания раствора и краску выливают в чашки Петри на срезы. Проверяют, нет ли выпадения осадков, при неудаче готовят новую порцию краски (при этом посуду тщательно перемывают) .

3. Срезы оставляют в краске при комнатной температуре на 18-24 часа, а в термостате при 37° -на 1-2 часа.

4. Основательно промывают в водопроводной воде. Срезы должны быть резко перекрашены, темно-синего цвета.

5. Дифференцируют в воде, подкисленной уксусной кислотой (из расчета 2-3 капли крепкой или ледяной уксусной кислоты на 200 мл воды) до тех пор, пока будут отходить грубые облачка синей краски (азур) и срез порозовеет. Обесцвечивание препарата идет быстро.

6. Основательно промывают в воде и доводят дифференцировку до конца одним чистым 96° спиртом, контролируя под микроскопом, пока отчетливо выделятся различные клеточные структуры. Хорошо дифференцированные срезы — бледно-синие с сиреневым оттенком.

7. Быстро проводят через абсолютный спирт, отжимают фильтровальной бумагой, просветляют ксилолом и заключают в бальзам. Применение абсолютного спирта необязательно.

Нельзя пользоваться карбол-ксилолом, креозотом и анилиновым маслом.

Можно употреблять эвкалиптовое, бергамотное и оригановое масла, но их надо тщательно удалять ксилолом.

Краску Романовского-Гимза в готовом виде.

ОКРАСКА АЗУР II-ЭОЗИНОМ

1. Срезы подготавливают так же, как и для окраски по способу Романовского—Гимза (см. пункт 1 метода Романовского-Гимза).

2. Готовят основные растворы из азура II и эозина (раствори­мого в воде), каждый из расчета 1 г на 1000 мл дистиллированной воды. Эти растворы довольно стойки и долго сохраняются (месяцами), но обязательно в темноте.

3. Непосредственно перед употреблением основные растворы красителей разводят дистиллированной водой следующим образом: берут 12 мл раствора эозина и доливают до 90 мл дистиллированной водой, а затем приливают 10 мл раствора азура II. Осторожно покачивая посуду, перемешивают смесь, получается раствор темно- фиолетового цвета.Готовую красящую смесь выливают на срезы. Следить за осадками.

4. Окрашивают в чашках Петри (на стеклянных палочках) или стаканчиках при комнатной температуре — 18—24 часа, а в термостате при 37° — 1—2 часа.

5. Промывают в водопроводной воде и дифференцируют как при окраске по способу Романовского—Гимза (см. пункты 5 и 6 метода Романовского—Гимза).

6. Быстро проводят через абсолютный спирт (необязательно), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Методика окраски капризная. Как уже было отмечено выше, успех в основном определяется качеством дистиллированной воды, употребляемой для приготовления красящих растворов.

Ввиду возможных неудач желательно одновременно пускать в работу побольше срезов.

Готовые препараты хранят в темноте.

При хорошем качестве красителей препараты сохраняются многими годами, в противном случае они постепенно обесцвечиваются.

ОКРАСКА МАЗКОВ КРОВИ ПО РОМАНОВСКОМУ — ГИМЗА

Общие замечания.

Для приготовления мазков крови берут тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла. Каплю крови помещают на конец предметного стекла и размазывают ребром другого (шлифованного) стекла. Чтобы получить хороший мазок, узкое ребро шлифованного стекла ставят слева от капли, непосредственно соприкасаясь с ней, под углом в 45°. Выжидают, пока капля крови расплывется, и тогда легким быстрым движением справа налево размазывают каплю. Капля должна быть соответствующей вели­чины, т. е. такой, чтобы при изготовлении мазка она была пол­ностью и без остатка исчерпана. При всех манипуляциях, связанных с приготовлением мазка, предметные стекла следует держать только за ребра. Приготовленный мазок сушат, помахивая препаратом до момента исчезновения влажного блеска. Высохший мазок фиксируют в метиловом или чистом 96° спирте (в стаканчиках); в первом — 3—5 минут, во втором — 10—15 минут. По окончании фиксации препарат вынимают из спирта пинцетом, ставят вертикально на фильтровальную бумагу и ожидают испарения спирта.

Методика окраски.

1. Разводят продажную краску Романовского—Гимза из расчета 1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды и помещают в нее фиксированный мазок на 15—20— 30 минут (в зависимости от качества красителя). Окрашивают в стаканчиках или чашках Петри.

2. Основательно промывают в дистиллированной воде и просушивают фильтровальной бумагой.

Препарат исследуют с иммерсионной системой.

Можно заключать в бальзам, тогда каплю последнего кладут на хорошо высушенный мазок и покрывают покровным стеклом (не толще 0,17 мм).

Результат:

ядра — лиловые;

базофильная зернистость лейко­цитов — темно-фиолетовая;

эозинофильная — красная;

нейтрофильная — розоватая;

кровяные пластинки — лиловые;

базофильная протоплазма лимфоцитов — синеватая.

Посуда, в которой приготовляют красящий раствор и окраши­вают мазки, должна быть безукоризненно чистой. Краску готовят по мере надобности и на свежей дистиллированной воде.

Есть и другие очень хорошие способы окраски кровяных мазков, как, например, Май—Грюнвальда, Лейшмана, Паппенгейма, описание которых можно найти в различных курсах по микроско­пической технике (С. П. Шуенинов, 1916; С. С. Вайль, 1947; Ромейс, 1953, и др.). В отношении результатов окраски все они сходны между собой и с краской Ро­мановского-Гимза.

Окрашивание по Паппенгейму

Предварительная фиксация мазков не требуется. На подсохшие на воздухе мазки наливают краску-фиксатор Мая —Грюнвальда на 3 мин. Не сливая краску, к ней добавляют такое же количество дистиллированной воды. Через 1 мин краску с мазка сливают и, не ополаскивая его, наливают профильтрованный рабочий раствор (разведение 1:4) готовой краски Романовского —Гимзы (при pH 6,8) на 5 мин. После окра­шивания препараты промывают дистиллированной водой и высушива­ют на воздухе, устанавливая вертикально в специальной сушке.

Для приготовления краски-фиксатора Мая—Грюнвальда 250 мг по­рошка Мая—Грюнвальда растворяют в 100 мл метилового спирта. Раствор подогревают при 70 °С на водяной бане да полного растворения порошка, фильтруют и хранят в бутылке с притертой пробкой.

Окрашивание по Паппенгейму в модификации Н. Ю. Полонской

Готовят 0,3% раствор красителя Мая—Грюнвальда (300 мг порошка красителя растворяют в 100 мл метилового спирта; раствор созревает 3 дня), раствор азура II (1 г растворяют в 1000 мл кипящей воды), раствор эозина калия или натрия (1 г эозина калия или 0,5 г эозина натрия растворяют в 1000 мл кипящей воды).

Высушенные мазки фиксируют в метиловом спирте 3 мин. Затем окрашивают 0,3% раствором Мая — Грюнвальда, на одну часть которого добавлено четыре части фосфатного буфера (pH 6,8 —7,2), 10 мин. Докрашивают азурэозином (одна часть раствора азура на одну часть раствора эозина и 5 частей фосфатного буфера при pH 6,8 —7,2) 20 мин. Смывают краситель проточной водой. Высушивают мазки на воздухе.

Окрашивание мазков по Лейшману

Готовят краску Лейшмана (2,5 г сухого красителя на 1 л метилового спирта; краситель созревает 3 — 4 дня), азур (1 г сухого красителя на 1 л дистиллированной воды, краситель созревает 3—4 недели); эозин (1 г сухого красителя на 1 л дистиллированной воды, краситель созревает 3-недели).

Высушенный на воздухе мазок переносят на 3 мин в краситель Лейшмана, промывают в водопроводной воде.

Удаляют (стряхивают) избыток воды и заливают красителем, в состав которого входят 40 мл азура, 30 мл эозина и 70 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 30-40 мин. Промывают водопроводной водой. Высушивают на воздухе или промокают фильтровальной бумагой.

Срочное окрашивание по Алексееву

Тонкие мазки фиксируют в подогретом до 35—40 °С растворе Мая— Грюнвальда 30 с.

Ополаскивают в воде.

Окрашивают в 0,1 % растворе азур- эозина (2:1) 2 мин.

Ополаскивают в воде и высушивают, промокая.

Окрашивание по Папаниколау и его модификации

Влажный препарат фиксируют в смеси Никифорова в течение 30 мин.

Если после фиксации его залить глицерином на 2 ч, то потом препарат можно хранить до 14 дней.

Перед окрашиванием препарат проводят через спирты нисходящей концентрации (100%, 95%, 80%, 50%) и дистиллированную воду (в каждом стаканчике держат по 2 мин).

Окрашивают гематоксилином в течение 10 мин (перед использованием раствор красителя необходимо фильтровать).

Промывают в 3-х сменах дистиллированной воды.

Затем переносят в смесь из 97 мл 70 % спирта и 3 мл концентрированного раствора аммиака (препарат становится синим). В этой смеси препарат необходимо ополоснуть несколько раз.

Опускают в 70 % спирт и затем промывают в проточной воде.

Опускают в раствор карбоната лития на 1 мин (3 капли насыщенного водного раствора на 100 мл дистиллированной воды). Промывают в проточной воде 5 мин.

Обезвоживают (дистиллированной водой и спиртами восходящей концентрации — 50 %, 70 %, 80 %, 100 %).

Докрашивают в течение 4 мин в оранжевом G (готовый раствор).

Ополаскивают в двух сменах 95 % спирта.

Опускают в краситель Папаниколау на 1 — 2 мин.

Ополаскивают в трех сменах 95 % спирта и двух сменах 100 % спирта (в последней смене держат 5 мин).

Просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Красители приготавливают следующим образом.

Раствор 1: 1 г кристаллического гематоксилина растворяют в 10 мл 100% спирта.

Ра­створ 2: 20 г алюмокалиевых квасцов при нагревании растворяют в 200 мл дистиллированной воды.

Через 24 ч растворы 1 и 2 смешивают и добавляют 0,5 г оксида ртути (красного), нагревают до кипения и охлаждают на водяной бане. Через 24 ч отфильтрованный раствор может быть использован. Каждый раз перед применением его следует фильтровать.

Краситель Папаниколау приготавливают следующим образом. Смешивают 45 мл 1,5 % раствора светлого зеленого (лихтгрюн) в 95 % спирте, 10 мл 0,5 % раствора основного коричневого (бисмаркбраун) в 95 % спирте, 45 мл 0,5 % раствора эозина в 85 % спирте, 0,2 г фосфорно­молибденовой кислоты и добавляют одну каплю насыщенного водного раствора карбоната лития (1 г на 100 мл дистиллированной воды).

Отечественные цитологи предлагают модификацию метода, в которой светлый зеленый заменен на более доступный бриллиантовый зеленый.

Окрашивание по Папаниколау в модификации Куницы

Оранжевый G: смешивают раствор 0,5 г оранжевого G на 100 мл 96 % спирта и 0,015 г фосфорно-молибденовой кислоты. Полученный раствор оставляют на 1 сут, после чего он годен для использования.

Чтобы приготовить промежуточный краситель и бриллиантовый зеленый, необходимо за 1 сут приготовить следующие водные растворы:

основного коричневого — 0,1 г на 1 л дистиллированной воды;

эозина (желтого или обычного) — 0,1 г на 1 л дистиллированной воды;

бриллиантового зеленого — 0,05 г на 1 мл дистиллированной воды  + 1 мл 96 % спирта.

Эти растворы необходимо плотно закрыть на 1 сут в термостате при 37 °С. Далее на них готовят спиртовые растворы красителей.

Промежуточный краситель: основной коричневый — 1 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта (если эозин обычный — 1 мл водного раствора на 260 мл 96 % спирта). Для получения промежуточного красителя, представляющего собой смесь, берут следующие количества вещества на 100 мл смеси: 16 мл спиртового раствора основного коричневого, 84 мл спиртового раствора эозина (желтоватого или обычного), 0,17 г фосфорно-молибденовой кислоты и добавляют одну каплю насыщенного раствора карбоната лития.

Красители фильтруют перед смешиванием, остаток хранят непрофильтрованным.

Бриллиантовый зеленый: 0,5 мл водно-спиртового раствора на 180 мл 96 % спирта.

Препарат фиксируют в смеси Никифорова (минимальная продолжительность фиксации — 30 мин).

Промывают в 96 % спирте, а затем дистиллированной воде.

Окрашивают гематоксилином 2 — 3 мин, промывают в воде.

Дифференцируют 0,5 % раствором соляной кислоты до покраснения в течение 2 — 3 мин, сливают, промывают в воде. Контролируют под микроскопом окраску ядер.

Опускают на 1 мин в слабый раствор карбоната лития (три капли насыщенного водного раствора лития на 100 мл дистиллированной воды), промывают в воде.

Тщательно обезвоживают мазок 96 % спиртом.

Окрашивают оранжевым G в течение 1 мин, наливая краситель на стекло. Сливают краситель и хорошо промывают спиртом до удаления его избытка.

Красят промежуточным красителем 1 мин, сливают, промывают в спирте.

Окрашивают бриллиантовым зеленым 1 — 2 мин, сливают, промывают спиртом, промокают.

Проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Окрашивание по Папаниколау в модификации Руденко

Вначале готовят водные растворы цитоплазматических красок: по 0,1 г светлого зеленого, эозина желтоватого водорастворимого и основного коричневого растворяют отдельно в 1 мл воды. Водные растворы, хорошо закрыв, оставляют на 1 сут в термостате при 37 °С. Затем из водных растворов готовят спиртовые растворы красителей:

светлый зеленый — 1 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта;

эозин желтоватый водорастворимый — 1 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта;

основной коричневый — 0,25 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта.

После этого готовят смесь, которую Г. Папаниколау назвал ЕА-36. Она состоит из смеси спиртовых растворов красителей: 200 мл светлого зеленого, 168 мл эозина желтоватого и 32 мл основного коричневого, которые перед смешиванием фильтруют. К смеси добавляют 0,68 — 0,8 г фосфорно-молибденовой кислоты и четыре капли насыщенного водного раствора карбоната лития.

В растворе красителя образуется небольшое количество устойчивого осадка, не мешающего работе. Полной готовности краска достигает через 3—12 дней при комнатной температуре.

Для приготовления оранжевого G 0,5 г сухого вещества растворяют в 100 мл 96 % спирта и добавляют 0,02 — 0,05 г фосфорно-молибденовой кислоты. Полученный насыщенный раствор готов к применению на следующий день. После того как использован весь раствор красителя, в эту же посуду с осадком можно добавить 100 мл 96 % спирта и указанное количество фосфорно-молибденовой кислоты. Оставшиеся количества спиртовых растворов эозина желтоватого и основного коричневого хранят и используют для приготовления красителя 3 — 6 мес.

Мазки фиксируют в жидкости Никифорова 30 мин.

Промывают в 96 % спирте 1 мин, затем в дистиллированной воде 2 — 3 мин.

Окрашивают в растворе гематоксилина 3 — 8 мин.

Ополаскивают в проточной воде 3 — 5 мин.

Проводят через 0,5 % раствор соляной кислоты 1 мин.

Промывают 2 — 3 мин в дистиллированной воде и 3 — 5 мин — в проточной, контролируя процесс под микроскопом.

Переносят в 0,1 % раствор карбоната лития на 1 мин.

Ополаскивают в дистиллированной воде и 96 % спирте.

Переносят в 100 % спирт на 1 мин.

Окрашивают в растворе оранжевого G 1 — 3 мин.

Проводят через 96 % спирт в течение 2 мин, контролируя процесс под микроскопом.

Окрашивают в светлом зеленом (смесь ЕА-36) 2 мин.

Проводят через 96 % спирт 1 — 3 мин.

Промокают фильтровальной бумагой, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Применяют следующий вариант окрашивания гематоксилином и эозином для мазков.

Для приготовления красителя 50 г алюмокалиевых квасцов растворяют в 500 мл дистиллированной воды, доводят до кипения и высыпают в горячий раствор 1 г гематоксилина. Затем добавляют 500 мл дистиллированной воды и доводят до кипения (но не кипятят). Раствор остужают до комнатной температуры и добавляют йодат калия. Горло сосуда завязывают марлей и оставляют созревать на свету 5 недель. Затем сосуд с красителем закупоривают и убирают в темное место. Перед использованием краситель фильтруют.

Мазки фиксируют в смеси равных частей эфира и 96 % спирта или в 96 % спирте 7—10 мин.

Окрашивают в гематоксилине 5 мин.

Промывают в проточной воде 1 — 2 мин.

Окрашивают в 0,3% спиртовом растворе желтоватого эозина 1 мин.

Промывают в проточной воде 1 — 2 мин.

Высушивают.