Окрашивание нервной ткани

Окрашивание нервной ткани

При морфологических исследованиях нервной ткани на светооптическом уровне применяют большое количество методов окрашивания, многие из которых модифицированы. Чаще всего это избирательные (элективные) методы, используемые для выявления одного или двух элементов. С определенной целью применяют комбинированные методы.

ФИКСАЦИЯ

При изучении нервной ткани из простых фиксаторов наиболее часто используют 10 — 20 % раствор формальдегида и 96 % и 100 % спирт, из фиксирующих смесей — сулему и пиридин. Существуют также специфические фиксаторы, применяющиеся только при исследовании элементов нервной ткани.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления глии):

нейтральный формалин 15 мл

бромид аммония 20 г

дистиллированная вода 85 мл

Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю —Хортеге.

Продолжительность фиксации тонких (до 1,5 см) кусочков материала 2 — 15 дней.

Промывание в проточной воде.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления нейро-фибрилл):

пиридин 40 мл

96 % спирт 30 мл

Продолжительность фиксации 2 ч.

Промывание в проточной воде в течение 1 ч.

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Особенностью обработки нервной ткани является ее тщательное обезвоживание. Для обезвоживания кусочков толщиной 5 —б мм используют следующую схему:

50 % спирт 2 ч

70 % спирт 6 ч

80 % спирт 6 ч

96 % спирт 6 ч

100 % спирт I 6 ч

100% спирт II 6 ч

Продолжительность обезвоживания 32 ч

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЛИВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет.

Заливка в желатин по Снесареву

Метод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.

Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12,5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности.

После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12,5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 — 2 ч до 1 — 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5— 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.

ОКРАШИВАНИЕ НЕЙРОНОВ

Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль  положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,— тигроидные глыбки;  глыбки, или вещество Ниссля.

Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».

Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl  - фиксация препаратов этиловым спиртом — выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.

==========================================================

Метод Ниссля

Фиксация.

Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.

Получение срезов.

Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 — 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.

Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10—15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.

Окрашивание срезов.

Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла, 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.

Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).

==========================================================

Окрашивание хроматофильной субстанции по методу Ниссля в модификации Майера

Приготовление раствора:

ТИОНИНА-2,0  и  БОРНОЙ КИСЛОТЫ-1,0 г. растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, затем прибавляют несколько  кристаллов  тимола.

Перед употреблением раствор фильтруют.

Методика  окрашивания:

Расправленные парафиновые срезы без наклейки на предметное стекло и без депарафинирования переносят в раствор тионина на 24  часа, при этом срезы должны плавать на поверхности красителя

Срезы вылавливают на предметное стекло, затем высушивают в термостате при 37"С. Депарафинируют срезы и заключают в канадский бальзам или полистирол

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Ядрышко и хроматофильная субстанция цитоплазмы сине-фиолетового цвета

Окраска по Нисслю

==========================================================

Упрощенный метод Ниссля

Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.

Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.

Методика окраски

1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.

2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.

3. Дифференцируют в 96 % спирте.

4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.

5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.

6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.

7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.

==========================================================

Метод Ниссля в модификации Снесарева

Одновременно с нервными клетками на препаратах, окрашенных по Нисслю, выявляются клеточные элементы мягкой мозговой оболочки и ее сосудов, внутримозговых сосудов, ядра глии и инфильтративные клетки, липофусцин, зеленый пигмент, базофильные коагуляты в сосудах, протоплазменная реакция астроцитов. Метод Ниссля также может быть использован для предварительной диагностики нейроэктодермальных опухолей и паразитарных поражений мозга.

Срезы материала, залитого в целлоидин, получают на санном микротоме. Толщина срезов 8-10 мкм. Их хранят в 96 % спирте.

Методика окраски

1. Срезы в 96 % спирте подогревают на водяной бане до появления пузырьков и охлаждают.

2. Переносят в 0,2 % раствор тионина, подогревают до появления паров и охлаждают.

3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды; проводят через 2 смены 96 % спирта (до побледнения срезов) по 30 —40 с в каждой.

4. При недостаточной дифференцировке тионина в спиртах проводят через эвкалиптовый спирт (10 мл 96 % спирта + 1 капля эвкалиптового масла) 3-5 с; тщательно ополаскивают в 3 сменах  96 % спирта, проводят через спирт-ксилол (2 части ксилола и 1 часть 96 % спирта), 100 % спирт-ксилол, ксилол.

5. Переносят на предметное стекло и заключают в бальзам.

6. Готовые препараты укладывают на доски и держат на свету до просветления фона (контроль под микроскопом).

Раствор тионина. Готовят из 1 г тионина и 500 мл дистиллированной воды. Тионин растирают в ступке в течение 45-60 мин, добавляя по каплям подогретую дистиллированную воду. Затем доливают оставшуюся дистиллированную воду, подогревают, доводят до кипения и фильтруют через 6 фильтров.

Перед использованием приготовленного раствора тионина его также следует профильтровать. Использованный краситель сливают в отдельный сосуд, так как он может быть вновь использован.

Результаты: на светлом фоне выявляются нервные клетки сине-фиолетового цвета различных оттенков.

Метод Ниссля отличается постоянством и большой надежностью результатов. Основой его успешного использования являются правильная фиксация материала и, что особенно важно, тщательное обезвоживание в спиртах восходящей концентрации при заливке в целлоидин или парафин. При несоблюдении этих условий препараты дают неотчетливое изображение, имеют зеленый оттенок и быстро обесцвечиваются.

==========================================================

ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНЫХ ВОЛОКОН

Методика выявления миелиновой оболочки по Шпильмейеру

Данная методика предназначена для элективного окрашивания миелиновых оболочек нервных волокон. Одновременно в белом веществе выявляется дренажная олигодендроглия.

Кусочки хранят в 10 % формалине, режут на замораживающем микротоме (толщина срезов 15 — 20 мкм). Срезы можно хранить также в 10 % формалине.

Методика окраски

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

2. Переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, и подсушивают на воздухе.

3. Погружают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2 сут (можно дольше) и держат в темном месте.

4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и обезжиривают в 96 % спирте 15 — 30 мин.

5. Помещают в гематоксилин (15 мл гематоксилина Бемера и 85 мл дистиллированной воды) на 1 сут и держат на свету.

6. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и дифференцируют в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов (контролируя процесс под микроскопом).

7. Промывают в дистиллированной воде, затем оставляют на 30 мин в проточной воде.

8. Просушивают на воздухе, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Гематоксилин Бемера готовят из двух растворов. Первый раствор: 1 г гематоксилина в 10 мл абсолютного спирта; второй: 8 г алюмокалиевых квасцов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды, после чего раствор остужают и фильтруют. Через 1 сут после приготовления растворы смешивают и дают смеси созреть на свету в широкогорлом открытом сосуде 10—14 сут, после чего фильтруют и добавляют несколько кристаллов тимола.

Раствор железоаммонийных квасцов: 2,5 г железоаммонийных квасцов и 100 мл дистиллированной воды размешать и профильтровать.

Результаты: на светлом слегка желтоватом фоне миелиновые волокна темно-серо-синеватого оттенка; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе того же оттенка.

В одном препарате редко удается одновременно выявить касательные (тангенциальные) и проекционные волокна, потому что для выявления миелиновых волокон разных систем (интракортикальные, проекционные и спаечные) требуется различная длительность дифференцировки срезов в железоаммонийных квасцах. В связи с этим одно стекло со срезом, окрашенным гематоксилином, с тем чтобы получить четкую архитектонику волокон, а также тонкую структуру миелиновой оболочки проекционных волокон, нужно более длительно дифференцировать в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов, тогда как для выявления архитектоники волокон и структуры миелиновой оболочки касательных (тангенциальных) волокон другое стекло со срезом, окрашенным гематоксилином, погружают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на более короткий срок. В процессе окрашивания могут появляться артефактные контрастные белые пятна неокрашенной ткани. В таких случаях срезы нужно более длительное время обезжиривать в 96 % спирте.

==========================================================

Метод Шпильмейера в модификации Соколянского

Данный метод применяют для выявления миелиновых оболочек нервных волокон. С его помощью более четко определяется волоконная архитектоника и структура волокна, но хуже окрашивается миелин. Одновременно окрашивается дренажная  олигодендроглия в белом веществе (при окраске головного мозга крыс лучше применять модификацию Соколянского).

Материал фиксируют в формалине.

Срезы толщиной 10 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме.

Методика окраски

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

2. Переносят на смазанное белком покровное стекло и подсушивают.

3. Помещают в насыщенный раствор бихромата калия на 24 ч (можно на несколько суток) и держат на свету.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Переносят в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов и держат в темноте 24 ч (можно дольше).

6. Ополаскивают в дистиллированной воде (необязательно).

7. Окрашивают в течение 24 ч (можно дольше) на свету в гематоксилине (15 мл гематоксилина Бемера + 85 мл дистиллированной воды).

8. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды.

9. Дифференцируют в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов.

10. Промывают в дистиллированной и проточной воде, проводят через 96 % спирт, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.

Результат: на сероватом фоне миелиновая оболочка центральных нервных волокон сиреневая; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе такого же оттенка.

==========================================================

Выявление миелиновой и нейрокератиновой оболочек по Авцыну

Материал фиксируют в формалине, заливают в желатин. Срезы толщиной до 10 мкм отмывают от формалина в 2 сменах дистиллированной воды, затем помещают в спиртовой раствор пиридина (чистый пиридин + 96 % спирт в соотношении 1:1) на 1 сут.

Методика окраски

1. Срезы промывают в 3 — 5 сменах дистиллированной воды и помещают в 0,5 % раствор нитрата серебра.

2. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.

3. Переносят в 10 % нейтральный формалин (3 порции, в каждой по 3 мин).

4. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.

5. Опускают в фосфорно-молибденовое серебро на 30 с.

6. Быстро ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

7. Переносят в 10 % нейтральный формалин на 2 мин.

8. Погружают в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.

9. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (в той же банке).

10. Помещают в 10 % нейтральный формалин на 2 мин. И. Ополаскивают в дистиллированной воде.

12. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (так до 3 — 4 раз, а для выявления тангенциальных волокон — до 7 раз).

13. Переносят в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.

14. Осторожно натягивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином.

15. Подсушивают на воздухе 8—10 мин, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Для приготовления фосфорно-молибденового серебра берут 4 мл 20 % раствора нитрата серебра и 1 мл 1 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты, добавляют по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка, доливают до 15 мл дистиллированной воды.

Результат: на светло-сиреневом фоне определяются нейрокератиновая и миелиновая оболочки нервных волокон черного цвета; в сосудах выявляются эритроциты черного цвета.

Для получения этих результатов требуется тщательное соблюдение методических рекомендаций: свежий, прозрачный раствор фосфорно-молибденового серебра, соответствующей толщины срезы, химически чистая посуда. В противном случае фон становится интенсивно коричневым, а серебро, применяемое для выявления нервных волокон, выпадает в осадок в виде зерен черного цвета.

==========================================================

Выявление оболочек нервных волокон по Хеквисту

Материал (кусочки ткани размером до 3 см) фиксируют в формалине, продолжительность фиксации не ограничена. После фиксации кусочек промывают до исчезновения запаха формалина.

Затем кусочки помещают в 5 % раствор бихромата калия на 14 дней, промывают в проточной воде 24 ч, проводят через спирты (70 %, 96 % и 100 %) и заливают в парафин.

Методика окраски

1. Срезы проводят через 100 %, 96 %, 80 %, 70 % спирты и дистиллированную воду.

2. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на ночь. Одновременно готовят краситель (35 мл 1 % водного раствора метиленового синего + 35 мл 1 % водного раствора желтого или красного эозина, через 1 сут после приготовления растворы сливают и добавляют 120 мл воды).

3. Срезы быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят на ночь в краситель.

4. Ополаскивают в воде, быстро проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам.

Результаты: на синем фоне ткани миелиновая оболочка нервных волокон приобретает окраску от розовой до ярко-красной, осевые цилиндры окрашиваются в темно-синий цвет.

Рисунок миелинового волокна может иметь размытый фон при задержке ополаскивания в воде.

==========================================================

==========================================================

ВЫЯВЛЕНИЕ ГАНГЛИЕВ И ИХ ОТРОСТКОВ

Среди методов импрегнации металлами первое место занимают методы импрегнации серебром Гольджи. Они основаны на образовании соединений серебра, которые осаждаются на отдельных ганглиозных клетках и их отростках, а также часто на глиальных клетках, сосудах и других образованиях. Наиболее распространен так называемый быстрый метод Гольджи. Во многих случаях вместо него можно использовать простой метод серебрения Шультце. Недостатком, но в то же время и достоинством метода Гольджи является то, что импрегнация никогда не распространяется на все клетки, ограничиваясь отдельными элементами. Благодаря этому получается картина, хотя и не полная, но более ясная, чем если бы были выявлены все клетки.

Метод Гольджи имеет большое значение не только для импрегнации нервных клеток, но и для выявления нервных окончаний, секреторных капилляров, железистых ходов, границ клеток и т.п. Хотя метод Гольджи позволяет получить лишь теневую картину, в соответствующих случаях с его помощью с успехом выявляют разнообразные тканевые элементы. При его использовании, конечно, нужно постоянно сознавать, что выявление структур основано на образовании осадка, который при известных обстоятельствах может дать картину не существующих в действительности структур. Нужно также учитывать, что выявленные клетки или структуры могут оказаться неполно импрегнированными. Какие именно образования будут импрегнированы, является в известной степени делом случая, так как условия, при которых происходит образование осадка, к сожалению, еще недостаточно известны. В связи с этим для правильной оценки полученных результатов требуются знания и опыт.

Ускоренный метод Гольджи

1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2,5 % (до 3,5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 — 25 °С в коричневую склянку на стек­лянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 — 6 кусочков. Ку­сочки не должны быть слишком большими или слишком малень­кими (толщина 2 — 3 мм, площадь поверхности 5 — 10 мм2).

Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 — 7 дней с промежутками около 12 ч.

2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0,75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до пре­кращения образования осадка, затем помещают на 1 — 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0,75 % раствора нитра­та серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.

3. Промывают в 40 % спирте (1 —2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 —4 ч, 4 % целлоидине 1 — 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.

Кусочки также можно поместить на 1—4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1:1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.

Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.

После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.

Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.

Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 —10-дневные животные). Особенно благоприятными объекта­ми являются головной и спинной мозг птенцов голубя.

Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 — 5 дней, для глии 2 — 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.

Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.

Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 — 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 — 3 % раствора бихромата калия и 4 —5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.

Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.

При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 — 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80—100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 — 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.

==========================================================

Медленный метод Гольджи

Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 — 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0,75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.

Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом

Оригинальная методика Гольджи

Данная методика является основной в изучении тонких структурных особенностей дендритов, шипиков и аксонной системы нейронов, позволяет более полно выявить морфологические особенности нейронов и межнейрональных связей.

1. Кусочки ткани мозга фиксируют в 10 % формалине от 1 до 15 дней. Увеличение продолжительности фиксации в формалине ухудшает качество импрегнации. Толщина кусочков не должна превышать 3 — 3,5 мм.

2. Фиксированные в 10 % формалине кусочки переносят (без промывания) на 3 сут в жидкость Мюллера в термостат.

3. Помещают (без промывания) в фиксатор, состоящий из 5 мл 1 % тетраоксида осмия и 25 мл 3 % бихромата калия, который готовят непосредственно перед использованием, ставят бюкс с притертой крышкой на 2 дня в термостат при температуре 37 °С. Для фиксации одного кусочка требуется не менее 30 мл указанной смеси.

4. Промывают кусочки в 2 сменах 1 % раствора нитрата серебра, приготовленного на 20 % растворе глюкозы.

5. Кусочки переносят в баночки из темного стекла на стеклянную вату и осторожно наливают раствор нитрата серебра на глюкозе (на 1 кусочек примерно 40 — 50 мл раствора). Обращаться с кусочками следует с большой осторожностью: брать их можно только пластмассовой или стеклянной лопаточкой, не следует пользоваться металлическим шпателем. Импрегнацию кусочков проводят в течение 14 — 20 дней в теплом месте.

Заливку в целлоидин проводят в течение 2 сут. Кусочки вырезают и наклеивают на блоки. Для более полного использования кусочков рекомендуется сделать на блоке подкладку из целлоидина, на которую кладут кусочек и заливают густым целлоидином. Кусочки подсушивают в парах хлороформа и помещают в 70 % спирт. Проводку по спиртам и заливку в целлоидин осуществляют в темноте, для этого баночки с кусочками следует покрыть колпачками из черной бумаги.

7. Режут кусочки на санном микротоме (толщина срезов 90—120 мкм). Серии срезов снимают с ножа кисточкой и помещают в 96 % спирт в чашки Петри, расправляя срезы кисточкой.

8. Каждый срез ополаскивают отдельно в 96 % спирте, затем переносят последовательно в две порции абсолютного спирта — в каждую на 30 мин.

9. Из 100 % спирта срезы переносят кисточкой на большие (60 х 90 или 32 х 40 мм) покровные стекла. Укладывают срезы в порядке серии. Стекла со срезами помещают в чашки Петри и осторожно заливают профильтрованным эвкалиптовым маслом. Если срезы при этом всплывают на поверхность, то их следует кисточкой вновь опустить на покровное стекло, помещенное на дно чашки Петри. В эвкалиптовом масле срезы должны находиться до просветления в течение 24 ч в темном месте. Эвкалиптовое масло можно использовать несколько раз (после фильтрации) до тех пор, пока оно не потемнеет.

Перед заключением в бальзам масло сливают, промокают срезы на покровных стеклах фильтровальной бумагой и заливают ровным слоем густого бальзама. После того как бальзам подсохнет (примерно в течение 3 сут), по краям покровного стекла со стороны бальзама приклеивают стеклянные, парафиновые или спичечные ножки.

Для приготовления жидкости Мюллера 3 г бихромата калия растворяют в 100 мл дистиллированной воды, можно подогреть, затем остудить и добавить 1 г сульфата натрия. Фильтровать раствор не нужно. Раствор хранят в темной стеклянной банке.

Результаты: на светло-желтом фоне выявляются нейроны с дендритами и аксонной системой, интенсивно импрегнированные в черный цвет.

==========================================================

Метод Гольджи—Дейнеки

(для выявления синапсов)

1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 % нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч.

2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2,5 мес.

3. Промывают в дистиллированной воде 3 — 4 мин.

4. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0,5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут.

5. Промывают в дистиллированной воде.

6. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь.

7. Переносят в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут).

8. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт.

9. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1,5 г тиосульфата натрия, 1,5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота).

10. Промывают 10 — 30 мин водопроводной, затем дистиллированной водой.

11. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 — 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты).

12. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавеле­вой кислоты на 1 — 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия).

13. Промывают дистиллированной водой и переносят в спирты восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %) по 2 —3 мин.

14. Проводят через карбол-ксилол 1—2 мин, 2 — 3 порции ксилола и заключают.

Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло-серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты — более интенсивно.

==========================================================

Метод Гольджи в модификации Блиновой

1. Материал фиксируют в 10 % формалине от 1 мес до 1 года (получены удовлетворительные результаты при фиксации в формалине более 1 года).

2. Кусочки ткани переносят в 2 % раствор бихромата калия (готовят на дистиллированной воде) на 2 сут в термостат при 25-30 °С.

3. Промывают в двух сменах 4 % раствора нитрата серебра, приготовленного на 20 % растворе глюкозы.

4. Помещают в такой же раствор нитрата серебра на 4— 5 сут при комнатной температуре в темном месте.

5. Не меняя раствор нитрата серебра, баночки с кусочками ткани переносят в термостат при 24 — 30 °С на 1 сут (более продолжительная импрегнация кусочков ткани в термостате ухудшает качество препаратов)

6. Кусочки ткани переносят в дистиллированную воду и получают срезы толщиной 40 — 50 мкм на замораживающем микротоме.

7. Обезвоживают срезы в спиртах восходящей концентрации (70%, 80%, 96%) и в 2 порциях 100 % спирта, проводят через ксилол, заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 4 % раствора нитрата серебра на 20 % растворе глюкозы растворяют 20 г глюкозы (можно заменить сахарозой) в 100 мл дистиллированной воды. В этот раствор добавляют 4 г нитрата серебра. В случае выпадения осадка раствору дают отстояться непосредственно перед применением. Подобным образом готовят и 1 % раствор нитрата серебра на 20 % растворе глюкозы.

Результат: на светло-желтом или почти бесцветном фоне нейроны с  дендритами и шипиками на них окрашены в интенсивно-черный цвет.

==========================================================

Метод Гольджи—Кокса (для животных)

1. Животное анестезируют нембуталом (эфир применять нельзя) в летальных дозах, затем берут кусочки головного мозга, быстро ополаскивают в теплом изотоническом растворе хлорида натрия и помещают в 50 мл следующей смеси: 20 мл 5 % раствора бихромата калия, 20 мл 5 % раствора сулемы, 40 мл дистиллированной воды. К этой смеси при постоянном помешивании добавляют 8 мл 5 % раствора бихромата калия. Кусочки в этом растворе помещают на стеклянную вату. Банки хранят в темном месте при комнатной температуре (не перемешивая) в течение 8 нед. Для коры головного мозга кошки, котенка и крысы этот срок меньше.

2. Кусочки без промывания ополаскивают в смеси равных количеств ацетона и 100 % спирта, затем помещают в такую же смесь на 24 ч в закрытой посуде.

3. Переносят в смесь равных количеств 100 % спирта и эфира на 4 ч.

4. Помещают в 5 % целлоидин на 24 ч, затем в 12 % целлоидин на 12 ч. Заливают на блоки и укрепляют хлороформом.

5. Срезы толщиной 100 — 120 мкм режут на микротоме в 70 % спирт.

6. Доводят до дистиллированной воды.

7. Осуществляют редукцию в 5 % растворе сульфата калия (к большому объему раствора добавляют несколько капель 5 % раствора щавелевой кислоты) для просветления фона и его обесцвечивания.

8. Промывают в дистиллированной воде в течение 5 мин. Проводят в смеси равных количеств спирта и хлороформа и наклеивают на предметное стекло 1 % раствором целлоидина.

9. Стекла со срезами проводят через смесь равных количеств абсолютного спирта и хлороформа.

10. Просветляют в скипидаре и заливают в бальзам.

==========================================================

Метод Глисса в модификации Владимировой

1. Небольшой кусочек ткани головного мозга погружают в жидкость Бодиана (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 90 мл 80 % спирта) на 3 — 4 дня.

2. Промывают в проточной воде в течение 24 ч.

3. Срезы толщиной 12 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают на 24 ч в 50 % спирт, добавив в него 10 капель крепкого аммиака.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в 10 % раствор нитрата серебра на срок от нескольких часов до 5 дней (пока срез не станет коричневым).

5. Не ополаскивая, переносят в 10 % формалин, меняя его несколько раз, пока не исчезнет муть.

6. Ополаскивают в проточной воде.

7. Погружают на 30 с (можно до 1 мин) в смесь, состоящую из 10 мл 100 % спирта и 10 мл 20 % раствора нитрата серебра (выпадающий осадок растворяют аммиаком, прибавляя его по каплям).

8. Переносят в 10 % формалин, меняя несколько раз до исчезновения мути.

9. Промывают в дистиллированной воде и помещают в 1 % раствор хлорного золота до появления стального цвета.

10. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия.

11. Промывают в дистиллированной воде.

12. Переносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, затем проводят через ацетон, ксилол, заключают в бальзам.

Результат: на сером фоне видны темные нервные клетки, ядра, нейрофибриллы в нервных клетках и синаптических волокнах, синаптические окончания.

==========================================================

Методы Бильшовского

Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность — 3 — 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные!) и применение чистых реактивов.

Импрегнация срезов

Материал фиксируют в растворе формалина (1:9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 —3 ч, затем в дистиллированной воде 1—2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной .5 — 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 — 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 — 4 раза.

Импрегнация:

1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;

2) быстро (2 — 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;

3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного се­ребра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия — образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0,875 — 0,910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 — 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 — 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;

4) быстро проводят через 2 — 3 порции дистиллированной воды;

5) восстанавливают в растворе формалина (1:4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, — срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;

6) промывают в воде 15 мин;

7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 — 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;

8) фиксируют 1—2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;

9) тщательно промывают в обычной воде (1—2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.

На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.

К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1:9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.

==========================================================

Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином

В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 — 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24— 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.

Тотальная импрегнация

Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 — 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0,5 — 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 —24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.

Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.

1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1:4 до 1:9), разрезают на кусочки толщиной не более 0,5 см и на 3 — 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.

2. Промывают 12 — 24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.

3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3 — 5 дней.

4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).

6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).

7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1:9) 10 — 12 ч.

8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.

При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.

Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.

М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.

Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 — 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.

С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.

==========================================================

Метод Адэра и Витгилию

(для выявления нейрофибрилл и синапсов)

Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 — 24 ч. Срезы толщиной 15—20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).

Далее проводят через дважды сменяемый спирт, промывают несколько раз в дистиллированной воде и обрабатывают 1 % трихлоридом золота до обесцвечивания. Промывают в 6 —8 порциях дистиллированной воды.

Для усиления окраски срезы обрабатывают 3 — 4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в   6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5—10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.

Результат:   хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.

 ==========================================================

Методы Рамон-и-Кахаля

Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.

Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.

В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.

Метод I.

Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.

1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 — 5 дней в 0,75 — 3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.

2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 — 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.

5. Заливают в целлоидин или парафин.

Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.

Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0,75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих—3 %, у беспозвоночных—6 % раствор. На 2—3 кусочка расходуют 80—100 мл раствора.

Метод II.

Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.

1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.

2. Разрезают на кусочки толщиной 2,5—3 мм, импрегнируют 5—7 дней в 1—1,5 % растворе нитрата серебра при 30—35 °С.

3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1—2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.

6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).

В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 — 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.

Метод III.

Особенно показан  для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.

Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1—12 капель (для большого мозга 1—3 капли, моз­жечка—4, спинного и продолговатого мозга—8—12, периферических окончаний — 2 —3) раствора аммиака (молекулярная масса 0,910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2—4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод IV.

Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.

Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 — 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод V.

Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).

Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12—24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод VI.

Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.

Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 — 24 ч в проточной воде и 2 — 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Импрегнация замороженных срезов.

Метод пригоден для исследования большого мозга, мозжечка, двигательных концевых пластинок, чувствительного эпителия.

1. Материал фиксируют в формалине (1:4) 3 дня или дольше.

2. Замороженные срезы толщиной 30-40 мкм собирают в формалин.

3. После быстрого (несколько минут) промывания в дистиллированной воде помещают в смесь, состоящую из 12 мл 2 % раствора нитрата серебра, 7-10 капель пиридина и 5-6 мл 97 % спирта, в которой срезы за 4-6 ч должны стать светло-коричневыми; если этого не происходит, то следует в течение нескольких минут подогреть над пламенем.

4. Отдельные срезы на 2—4 с погружают в 100 % спирт.

5. Восстанавливают 1—3 мин в смеси, в состав которой входят 0,3 г гидрохинона, 70 мл дистиллированной воды, 20 мл формалина и 15 мл ацетона.

6. Основательно промывают в воде, золотят и фиксируют как обычно.

7. Промывают, извлекают на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой.

8. Проводят через 100 % спирт, гвоздичное масло, ксилол, заключают в бальзам.

В том случае, если с помощью этого метода не удается выявить мякотные волокна белого вещества, то перед серебряной ванной замороженные срезы 2 ч обрабатывают в смеси, состоящей из 10 мл 100 % спирта, 10 мл дистиллированной воды и 8-10 капель аммиака. Затем промывают, помещают в раствор нитрата серебра с пиридином и т.д.

==========================================================

Метод Рамона—Лермитта

(выявление дегенерированных синапсов)

Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 — 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 — 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга — 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга — 60 мин, мозжечка и таламуса — 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.

1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).

2. Промывают в дистиллированной воде.

3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.

4. Переносят в 0,5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.

5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.

6. Промывают в дистиллированной воде (2 — 3 смены)

7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.

8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.

==========================================================

Методика Бильшовского

(выявление внутриклеточных нейрофибрилл,

осевых цилиндров нервных волокон и сенильных бляшек)

Служит наиболее адекватной методикой для микроскопической диагностики болезни Альцгеймера и старческого слабоумия.

Материал фиксируют в 10 % формалине не менее 2 нед. Срезы толщиной 8—10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в 10 % формалине, перед окраской промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

1. Переносят срезы на 24 ч в 2 % раствор нитрата серебра.

2. Ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

3. Переносят в аммиачное серебро на 25 — 30 с.

4. Тщательно ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

5. Помещают в 20 % нейтральный формалин на 4 —5 с до приобретения темно-коричневой окраски.

6. Ополаскивают в дистиллированной воде.

7. Переносят 1—3 среза в 0,5 % раствор трихлорида золота (они должны приобрести светло-серый, мышиный, цвет без коричневых пятен).

8. Переносят в дистиллированную воду (если на срезах появятся коричневые пятна, то вновь помещают в раствор трихлорида золота до их исчезновения).

9. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. Стеклянную палочку после погружения со срезом в тиосульфат натрия следует тщательно промыть в дистиллированной воде, протереть чистой тканью. Переносить срезы из тиосульфата натрия в трихлорид золота не следует, так как последний в этом случае темнеет и становится непригодным для использования.

10. Срезы промывают в дистиллированной воде, наклеивают на стекло, смазанное смесью белка с глицерином, затем ставят на ребро для просушки на 8 — 10 мин.

11. Просветляют в одной порции ксилола и заключают в бальзам под покровное стекло. Если препарат просветлен не полностью, т.е. имеются мутные пятна, то его следует погрузить на 2 — 3 с в ацетон, а затем вновь поместить в ксилол. Эту процедуру повторяют до полного просветления срезов.

Результат: на светлом фоне импрегнируются контуры нейронов, их ядер; в телах нейронов выявляются тонкие волокна нейрофибрилл или их патология. Между клетками видна тонкая сеть аксонов и их коллатералей. Аксосоматические терминали на поверхности тел нервных клеток выявляют изредка и частично, поэтому о количестве их говорить нельзя. Иногда в белом веществе обнаруживают волокнистые астроциты.

При правильной предварительной фиксации материала с помощью этого метода постоянно получают хорошие результаты. Засорение срезов осадками серебра происходит при использовании плохо обработанной посуды и недоброкачественного раствора серебра. При недостаточной дифференцировке в растворе трихлорида золота структуры выглядят грубо импрегнированными с коричневым оттенком, в срезе определяются коричневые пятна.

==========================================================

==========================================================

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГЛИИ

Методика Снесарева

(выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон)

Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках — феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию.

Материал фиксируют в 10 % формалине.

Срезы толщиной 8— 10 мкм получают на замораживающем микротоме.

1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 — 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя).

2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски.

3. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 —40 с.

4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа).

5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая—Грюнвальда на 3 — 5 с.

6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 — 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой.

7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 0,5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 — 3 ч в термостат при 37 — 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным).

Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки — ядро и прилежащая цитоплазма,— становится розовой: от ярко­го цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета.

Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая — Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8—10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.

==========================================================

Методика Рамон-и-Кахаля

(выявление волокнистой и астроцитарной глии)

Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 — 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).

2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.

4. Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания.

5. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.

Результат: в белом веществе на сиреневом фоне (разной интенсивности) четко определяются черновато-фиолетовые фиброзные астроциты, а в сером веществе — более светлые.

==========================================================

Методика Мийагавы в модификации Александровской

(выявление мезенхимной глии)

Методику используют для выявления клеток микроглии, перицитов (гематогенных гистиоцитов), а также клеток олигодендроглии (плотных и дренажных). Одновременно обнаруживают зернистые шары и дельта-зернистость; в мягкой мозговой оболочке окрашиваются пигментные клетки (хроматофоры), могут выявляться фиброзные астроциты.

Материал фиксируют в 10 % формалине не менее 12 дней, затем промывают проточной водой в течение 2 сут и заливают в желатин. Вырезанные из желатина кусочки помещают в 10 % кислый формалин на 1 сут (в нем их можно длительно хранить). Перед резкой на замораживающем микротоме желательно промыть кусочки в проточной воде около 1 — 2 ч (материал лучше режется).

Толщина срезов 15-20 мкм.

Срезы хранят в 10 % кислом формалине.

1. Срезы промывают в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в 10 % кислый формалин на 20 мин (можно до 3 ч).

2. Переносят без промывания в щелочной раствор (1 капля гидроокиси натрия на 10 мл дистиллированной воды) на 40 —60 с.

3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды.

4. Импрегнируют в растворе аммиачного серебра 1 —2 мин.

5. Переносят в горячий 10 % кислый формалин, который подогревают под вытяжкой на спиртовке. В случае помутнения формалина его следует заменить. В горячем формалине срезы приобретают золотистый цвет.

6. Помещают в холодный 10 % кислый формалин (в нем их можно оставить до следующего дня).

7. Промывают в 2 — 3 сменах водопроводной воды, наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином и дают просохнуть на воздухе.

8. Просветляют в ксилоле (если на препарате видны мутные пятна, то его опускают на 2 — 3 с в ацетон и вновь переносят в ксилол до просветления), заключают в бальзам под покровное стекло.

В случае недостаточного выявления микроглии, особенно олигодендроглии, желатиновые срезы следует перенести из формалина, в котором их хранят, в смесь Дубранского (срезы перед этим промывают в 2—3 сменах дистиллированной воды) на срок от 2—3 сут до 2—3 нед, обязательно меняя смесь через 2—3 дня.

Для приготовления смеси Дубранского в 100 мл нагретой до кипения дистиллированной воды осторожно всыпают 6 г гидрокарбоната натрия, еще раз доводят до кипения, охлаждают, фильтруют. В полученный раствор добавляют 6 мл неразведенного нейтрального формалина и 6 капель 25 % аммиака.

Результат: на светло-янтарном фоне видны ветвистые клетки микроглии, перициты, плотные и дренажные клетки олигодендроглии, имеющие цвет от светло-коричневого до темно-коричневого. Дренажные клетки в белом веществе ткани головного мозга светло-коричневые, часто светло-желтые. Хроматофоры в мягкой мозговой оболочке, изредка в сосудах вещества мозга — черного цвета. Иногда в белом веществе коры и подкорковых образованиях одновременно выявляют волокнистые астроциты светло-коричневого цвета. Старческие бляшки имеют цвет от светло- до темно-коричневого.

==========================================================

Метод Хорнеца (выявление фиброзных астроцитов)

Материал фиксируют в 10 % кислом формалине, срезы получают на замораживающем микротоме. Хорошие результаты удается получить также на материале, заключенном в парафин.

1. Срезы переносят в дистиллированную воду, на 100 мл которой добавлено 15 капель раствора аммиака (недолго).

2. Помещают в 5 % раствор бромисто-водородной кислоты на 1 ч при температуре 37 °С.

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды, а затем в дистиллированной воде, к которой добавлено несколько капель уксусной кислоты.

4. Переносят на 15—24 ч в раствор, состоящий из 1 г трихлорида золота в 75 мл дистиллированной воды +25 мл 2 % сулемы+18 мл дистиллированной воды + 15 капель уксусной кислоты, препараты приобретают темно-коричневую или красно-коричневую окраску.

5. Помещают в 5 % раствор щавелевой кислоты (до приобретения ими серой окраски).

6. Ополаскивают в дистиллированной воде, переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия с несколькими каплями раствора аммиака; быстро ополаскивают и заключают.

Результат: на сиреневом фоне выявляются темно-синие фиброзные астроциты с отростками, видны капилляры и красные эритроциты в их просвете.

Возможные осложнения: при использовании старого раствора бромисто-водородной кислоты и передержке в ней препарата выпадают артефактные синие глыбки неправильной формы.

==========================================================

==========================================================

КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ

Ускоренный метод окрашивания миелиновых волокон и нервных клеток по Викторову

Депарафинированные срезы окрашивают в течение 1 —2 ч в 0,01 % кислом спиртовом растворе люксолевого синего прочного, дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия (буры) и докрашивают крезиловым фиолетовым прочным по Нисслю.

Растворы красителей и их изготовление.

Раствор I: 1 г люксолевого синего прочного, 5 мл ледяной уксусной кислоты, до 100 мл 96 % спирта. Для приготовления рабочего 0,01 % раствора

1 мл основного раствора красителя смешивают со 100 мл 96 % спирта. Рабочий раствор красителя можно использовать повторно.

Раствор II: 250 — 500 мг крезилового фиолетового прочного, 130 мг ацетата натрия, 1,2 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. Забуференный раствор крезилового фиолетового прочного для подкрашивания по Нисслю можно использовать неоднократно.

Методика окраски

1. Наклеенные на стекла парафиновые срезы толщиной 10 — 20 мкм депарафинируют в ксилоле и промывают в 100 % и 96 % спиртах.

2. Окрашивают в 0,01 % спиртовом растворе люксолевого синего прочного 1 — 2 ч при 56 — 60 °С.

3. Промывают срезы последовательно в 96 % и 70 % спиртах и дистиллированной воде.

4. Дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия, контролируя процесс под микроскопом (краситель постоянно удаляется из среза, а миелиновые волокна сохраняют яркую сине-зеленую окраску).

5. Ополаскивают в 5 % растворе уксусной кислоты.

6. Окрашивают крезиловым фиолетовым прочным в течение 2 — 5 мин.

7. Промывают в дистиллированной воде.

8. Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: миелин ярко-синего цвета; вещество Ниссля, ядра нейронов, глиоцитов, клеток сосудов и оболочек мозга фиолетовые.

==========================================================

Метод избирательной импрегнации дегенерированных нервных волокон и окончаний

Фиксацию мозга лабораторных животных проводят методом прижизненной перфузии 10 % раствором нейтрального формалина на изотоническом растворе хлорида натрия через левый желудочек сердца. После перфузии мозг дополнительно фиксируют в течение 10—14 дней в 10 % растворе нейтрального формалина, а за 1 — 2 дня перед резкой помещают в 30 % раствор сахарозы, что предупреждает повреждение ткани при замораживании. В растворе формалин-сахарозы мозг может храниться долго.

Срезы толщиной 25 — 40 мкм, полученные на замораживающем микротоме, собирают в 10 % раствор формалина, в котором и хранят до последующей обработки.

Растворы и их приготовление.

А. Кислый раствор соли пятивалентного ванадия: навеску в 1,2 г метаванадата аммония (аммоний ванадиевокислый) растворяют в 150 — 200 мл горячей дистиллированной воды, после охлаждения раствора к нему добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Удобно готовить также концентрированный раствор: 12 г метаванадата аммония растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды. К полученному раствору после охлаждения небольшими порциями добавляют 50 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Если при добавлении серной кислоты выпадает бурый осадок пятиокиси ванадия, то его растворяют при нагревании. Перед применением к 1 части концентрированного раствора добавляют 9 частей дистиллированной воды. Кислый раствор метаванадата аммония может храниться в течение длительного времени.

Б. Раствор нитрата серебра 3 %.

В. Аммиачно-натриевый раствор: в 100 мл 25 % водного раствора аммиака растворяют 1,25—1,5 г гидроксида натрия. Раствор хранят в плотно закрытой склянке с полиэтиленовой пробкой.

Г. Раствор аммиачного серебра (готовят перед использованием): к 50 мл 3 % аммиачного серебра добавляют 6 мл аммиачно-натриевого раствора.

Д. Редуцирующий раствор: 27 мл 10 % формалина, 87 мл 1 % лимонной кислоты, 90 мл 96 % спирта, до 1000 мл дистиллированной воды.

Е. Смесь равных объемов 1 % раствора тиосульфата натрия и 1 % раствора сульфита натрия.

Импрегнация срезов

1. Срезы промывают в течение 5 мин в 2 сменах дистиллированной воды.

2. Помещают в кислый раствор метаванадата аммония на 10— 15 мин.

3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды 5 мин.

4. Переносят на 25 — 30 мин в 3 % раствор нитрата серебра (срезы приобретают светло-коричневый цвет). Далее каждый срез обрабатывают отдельно.

5. Ополаскивают в дистиллированной воде (5— 10 смен).

6. Помещают на 1 — 2 мин в раствор аммиачного серебра.

7. Без предварительного промывания проводят через 2 смены редуцирующего раствора (1-я смена — 1 мин, 2-я смена — 2 — 3 мин).

8. Промывают 1 — 2 мин в дистиллированной воде.

9. Помещают на 1 — 2 мин в смесь равных объемов 1 % растворов тиосульфата натрия и сульфита натрия.

10. Тщательно промывают в 2 сменах дистиллированной воды в течение 10—15 мин.

11. Промытые срезы наклеивают на предметные стекла спиртовым раствором желатина и хромовых квасцов (в 200 мл 0,5 % раствора желатина растворяют 100 мг хромовых квасцов; чистые предметные стекла погружают в этот раствор, вынимают и сушат в вертикальном положении). Наклеенные и хорошо просушенные срезы обезвоживают спиртом, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Примечания. 1. Продолжительность обработки срезов, описанной в пунктах 2, 4, 6, определяют опытным путем для каждой серии срезов.

2. Качество препаратов значительно улучшается, если срезы, наклеенные на предметные стекла, докрасить растворами крезилового фиолетового прочного или толуидинового синего.

Результат: фон препаратов светло-желтый, реже коричневый; дегенерированные волокна — черные; в местах окончания дегенерированных волокон выявляют тела нервных клеток и ядра нейроглии, имеющие различные оттенки фиолетового цвета.

==========================================================

Методика дифференцированного выявления нейронов и глии на парафиновых срезах

Гистохимические методы, в частности методы определения белковых веществ, не позволяют дифференцировать типы глии, поскольку обычно у глиальных клеток различимы только структу­ры ядра. Ставя задачу разработать метод дифференцированно­го определения нейронов и глиальных элементов на гистохимических препаратах, авторы попытались объединить метод Альцгеймера, предназначенный для выявления митохондрий, нейросом, телец Ниссля и астроцитарной глии, и гистохимический  метод определения общего белка с применением амидо черного 10Б. Метод Альцгеймера основан на различном сродстве органоидов клетки к красителям: в нейронах митохондрии и нейросомы окрашиваются в ярко-красный цвет, вещество Ниссля — в зеленый, а тела амебовидных клеток — в зеленоватый, глиальные и соединительнотканные волокна — в красный. Метод с применением амидо черного 10Б позволяет обнаружить общий и суммарный белок в ткани мозга по окрашиванию его скоплений в зеленый цвет. В результате исследования разработана следующая схема.

Кусочки ткани мозга после фиксации в жидкости Карнуа проводят по обезвоживающим средам и заключают в парафин. Срезы толщиной 5—10 мкм приклеивают белком на предметные стекла.

1. Срезы депарафинируют и через спирты нисходящей концентрации доводят до воды.

2. Переносят в 0,03 % раствор амидо черного 10Б на ацетатном буфере (рН 5,32) при комнатной температуре на 20 мин.

3. Промывают в дистиллированной воде.

4. Инкубируют в насыщенном водном растворе кислого фуксина при 56 °С 30 мин.

5. После охлаждения до комнатной температуры ополаскивают в дистиллированной воде.

6. Дифференцируют в пикриновой кислоте (15 мл насыщенного спиртового раствора пикриновой кислоты и 30 мл дистиллированной воды) 15 с.

7. Ополаскивают в дистиллированной воде и обсушивают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют в 100 % спирте около 2,5 с.

9. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: отчетливо выявляются белки в телах и митохондриях нейронов, а также в ядрах глиальных клеток. Последние значительно различаются по интенсивности окраски в зависимости от принадлежности к тому или иному типу глии: кариоплазма и хроматиновые структуры ядер олигодендроглиоцитов интенсивно-красного цвета, а у астроцитов в красный цвет окрашены ядрышко и небольшое количество зерен хроматина.

==========================================================

Метод Герлаха

Для выявления грубых отростков ганглиозных клеток и более крупных тяжей волокон рекомендуется метод Герлаха. При этом важно, чтобы препараты до окрашивания кармином не соприкасались со спиртом.

Материал фиксируют в жидкости Мюллера или 3 — 5 % растворе бихромата калия. Продолжительность фиксации мозга птиц и лягушек составляет несколько недель, головного и спинного мозга человека — несколько месяцев и даже лет. Срезы получают на замораживающем микротоме и в течение нескольких часов промывают в воде. Окрашивают в разбавленном растворе аммиачного кармина 24 — 48 ч. Очень важно правильно приготовить раствор: растирают 1 г кармина, приливают 100 мл дистиллированной воды и добавляют по каплям 26 % раствор аммиака (нашатырный спирт) в таком количестве, чтобы краситель полностью растворился. После этого раствор должен созреть в открытом сосуде до полного исчезновения запаха аммиака. К употреблению годны лишь растворы, стоявшие в течение длительного времени. Перед использованием основной раствор разбавляют дистиллированной водой настолько, чтобы для окрашивания срезов потребовалось 24 — 48 ч. Раствор кармина можно использовать повторно (со временем он даже становится лучше). Срезы дифференцируют в слабо подкисленной уксусной кислотой воде 1 — 2 ч; промывают, проводят через спирты возрастающей концентрации, ксилол и заключают в бальзам.

Результат: ганглиозные клетки с отростками интенсивно-красные; осевые цилиндры нервных волокон и ядра клеток красные; волокна глии розовые; мякотные оболочки остаются неокрашенными. Если срез предварительно окрасить гематоксилином, то ядра окрашиваются контрастно в синий цвет.