Обработка и окрашивание костной ткани
для гистологических исследований.
Декальцинация.
Прежде чем приступить к декальцинации, кость, как и любую ткань, необходимо подвергнуть фиксации. Выбор фиксатора зависит от целей и характера исследования. Так, для озорных препаратов и выявления фибриллярных компонентов костной ткани применяют чистый формалин (15-20% Раствор), в то время как для цитологических исследований предпочтительней сложные фиксаторы, также содержащие формалин, ибо он уменьшает степень набухания волокнистых структур, при последующей обработке ткани ( например , фиксатор Штиве: насыщенный водный раствор дихлорида ртути - 76мл, формалин 20 мл, ледяная уксусная кислота- 4 мл)
Для фиксации следует выпиливать лобзиком небольшие кусочки кости (толщиной 0.5-1 см), так как из-за высокой плотности ткани фиксатор проникает медленно. Срок фиксации зависит от толщины кусочка (не менее 48 часов)
При окончании фиксации объект тщательно промывают в проточной водопроводной воде или спирте (например, после сложных фиксаторов, содержащих дихлорид ртути), так как при последующей обработке кислотами могут образоваться труднорастворимые осадки. После этого с целью обезжиривания препарата проводят через ряд спиртов повышающейся концентрации (50, 70 и 96%), а затем доводят до воды через спирты нисходящей концентрации.
Декальцинация достигается обработкой костной ткани с помощью декальцинирующих жидкостей, обладающих свойствами растворять неорганические соли, не повреждая структурные элементы кости.
При декальцинации следует придерживаться следующих основных правил:
1. Применять большое количество декальцинирующей жидкости и сменять ее ежедневно (объем жидкости должен превышать объем объекта не менее чем в 50-70 раз);
2. Декальцинируемый объект помещать в верхним слое жидкости, чтобы обеспечить опускание на дно растворяющихся солей (подвешивание кусочков на нитке или стеклянном сите);
3. Проводить декальцинацию до полного удаления минеральных солей (но не передерживать материал в жидкостях, так как это приводит к набуханию фибрилл и ухудшению окрашиваемости структур)
Декальцинация считается полной тогда, когда объект становиться мягким и режется ножом легко и без хруста. Ход процесса можно проверить по степени погружения в объект препаровальной иглы. Сгибать препарат и надавливать на него не рекомендуется, так как это приводит к повреждению тонких структур кости.
Декальцинация в в одном растворе АЗОТНОЙ КИСЛОТЫ (5-7,5 %) ЯВЛЯЕТСЯ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫМ СПОСОБОМ. Для приготовления рабочего раствора в мерную колбу наливают 5-7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и доливают до 100 мл дистиллированной воды (раствор можно готовить в прок в больших количествах, рассчитав общую потребность). Применять более низкие и более высокие концентрации растворов для декальцинации кости не рекомендуется, так как первые вызывают набухание, а вторые- повреждение клеточных структур. Более высокие концентрации (до10%) используют лишь для декальцинации зубов.
Налив нужное количество жидкости в подходящий стеклянный сосуд, в нее подвешивают подготовленный к декальцинации кусочек кости. Раствор меняют ежедневно до наступления полной декальцинации. Срок декальцинации зависит от свойств объекта (плотность, величина) и концентрация азотной кислоты. Средняя продолжительность декальцинации небольших кусочков компактной костной ткани 10-12 суток.
По окончании декальцинации для устранения набухания волокнистых структур препарат подвешивают на 24 часа в 5% раствор СУЛЬФАТА НАТРИЯ Na2SO4 или ЛИТИЯ Li2SO4 ( в случае отсутствия таких солей кость следует поместить в 96% спирт) и лишь после этого тщательно промывают в течение 1-2 суток в проточной водопроводной воде.
Можно сократить срок получения декальцинированной кости, поместив выпиленный кусочек непосредственно в 5% раствор трихлоруксусной кислоты, содержащий 10-20% формалина. Эта смесь одновременно фиксирует и декальцинирует. Маленькие кусочек средней плотности можно декальцинировать за 3-5 дней. После декальцинации после декальцинации промывают в спирте (НИВКОЕМ СЛУЧАЕ НЕ В ВОДЕ!!!)
Существует ряд других способов декальцинации, но все они основаны на одном и том же принципе и требуют соблюдение изложенных выше общих правил.
После декальцинации костную ткань можно резать на замораживающем микротоме, а также заливать в целлоидин или целлоидин - парафин обычным путем. Заливка в парафин не рекомендуется, так как он плохо пропитывает декальцинированную кость.
ОКРАШИВАНИЕ
Наиболее распространенный метод окрашивания срезов декальцинированной костной ткани –по Шморлю (ТИОНИНПИКРИНОВАЯ КИСЛОТА).
Рабочие растворы:
А- насыщенный раствор тионина в 50% спирте.
Б-1% водный раствор фенола.
В- насыщенный раствор пикриновой кислоты.
Перед употреблением сливают 1 часть раствора (А) с 10 частями раствора (Б). Находящееся в воде срезы переносят на 10 мин в полученную смесь, после чего споласкивают в дистиллированной воде и помещают на 30-60 с в насыщенный раствор пикриновой кислоты. Затем срезы вновь споласкивают в дистиллированной воде и дифференцируют в 70% спирте до получения темно-красной окраски. После этого их переносят в 96% спирт, в котором продолжают дифференцировку (под контролем микроскопа до тех пор, пока общий фон среза не приобретет коричневый (или болотный) цвет, а костные клетки и их отростки - красный. Окрашенные срезы затем проводят через 96% и абсолютный спирт, карбол - ксилол, ксилол и заключают в полистирол.
Если срезы плохо окрашивается из-за длительной декальцинации в азотной кислоте, его нужно предварительно поместить на 2 3 ч в о,5% аммиачную воду, после чего хорошо промыть, в дистиллированной воде и затем окрасить.
| 
