БЕШЕНСТВО
Методические указания по лабораторной диагностике бешенства
(Утверждены Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 27 февраля 1970 г.)
Возбудитель — вирус из семейства Rabdovirusis, его размер 100—150 ммк.
Материалом для исследования на бешенство служит свежий труп мелких животных (собака, кошка, лисица, песец, овца, теленок и др.), голова крупных животных или головной мозг свежий или консервированный в 30—50%-ном растворе глицерина. Его направляют в лабораторию с нарочным.
Из головного мозга делают засев на питательные среды. Часть мозга помещают в стерильный 50%-ный глицерин на буферном или физиологическом растворе и сохраняют в холодильнике на случай необходимости повторного исследования. Из оставшейся части мозга берут материал для микроскопического исследования, серологических реакций и биологической пробы.
Вскрытие трупа, изъятие мозга и другие работы необходимо проводить в условиях асептики при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, защита рук двумя парами перчаток — хирургическими и анатомическими, для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот марлевую повязку).
Микроскопические исследования.
Для микроскопического исследования делают отпечатки, мазки или срезы из разных участков головного мозга.
Для приготовления отпечатка кусочки головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в 4—6 слоев, срезанной поверхностью кверху. К поверхности среза несколько раз (3—4) подряд прикасаются чистым предметным стеклом, слегка надавливая его, чтобы на стекле получился тонкий отпечаток.
Мазки делают из тех же участков головного мозга. Для этого кусочки мозга растирают в фарфоровой ступке пестиком или в пробирке стеклянной палочкой до образования гомогенной массы, из которой делают грубые мазки на обезжиренном предметном стекле. Можно делать мазки и другим способом. Для этого небольшой кусочек мозга кладут на край предметного стекла, а другим стеклом раздавливают его и размазывают от одного края до другого, в результате чего на поверхности стекла получается тонкий равномерный мазок.
Полученные мазки или отпечатки окрашивают одним из следующих способов.
Окраска по Муромцеву. Влажные мазки или отпечатки сразу же фиксируют в этиловом или метиловом спирте, или в смеси спирта пополам с эфиром, или ацетоном (химически чистым,) в течение 1—2 часов и промывают водой. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы фиксирующая жидкость не испарялась. После промывания водой влажные мазки помещают на 5—10 минут в раствор краски Мансона, разведенной водой 1 :40. Затем краску сливают, а мазки погружают в 10%-ный водный раствор танина на 8—10 минут до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом и высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, ядра нервных клеток синего цвета, а тельца Бабеша—Негри — бледно-фиолетовые с темными включениями.
Окраска по Селлерсу. На приготовленный влажный от-печаток или мазок наносят на 4—5 секунд смесь реактива А (метиленовый синий 2 г, метиловый спирт 100 мл) и реактив В (основной фуксин 0,5 г, этиловый спирт 100 мл). Рабочий раствор красителя состоит из 15 мл реактива А, 2—4 мл реактива В и 25 мл метилового спирта. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают.
В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша— Негри пурпурно-красные с отчетливо видной базофильной структурой.
Окраска по Михину. Мазки или отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5—10 минут, после чего их просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают 30— 40 минут краской Гимза (1—2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96°-ного спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и исследуют. Если материал был в глицерине, то его предварительно хорошо промывают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.
В окрашенном препарате при микроскопическом исследовании основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. Если преобладает синий фон, мазок снова обмывают подкисленным спиртом и водой. Пирамидальные нервные клетки синеватые, ядро интенсивно черное, а тельца Бабеша—Негри — розово-красные с точечными включениями темно-синего цвета.
Окраска по Борману — Гайнуллиной. Тонкие мазки или отпечатки в течение 5 минут фиксируют в смеси следующего состава: спирта и эфира (поровну) 98 мл, ледяной уксусной кислоты 2 мл. После фиксации их погружают на 5 минут в 10%-ный раствор кристаллической соды, а затем промывают водой и просушивают на воздухе.
Зафиксированные мазки в течение 2 минут окрашивают краской, приготовленной перед употреблением (состав краски — насыщенный водный раствор метиленовой сини 3 капли, насыщенный основной раствор фуксина 2 капли, водопроводная вода 20 мл). Раствор краски наливают на мазок, подогревают на пламени горелки, затем краску оставляют еще на одну минуту, после чего промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.
В окрашенном мазке основной фон должен быть ярко-красным, протоплазма нервных клеток красновато-синяя, их ядра — темно-синие, тельца Бабеша—Негри — землянично-красные с типичной гранулярной структурой. Эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков.
Серологические исследования.
Реакцию диффузной преципитации в агаровом геле применяют для обнаружения специфического рабического антигена в головном мозге животных, павших от уличного бешенства, а также у животных, на которых ставили биопробу.
Реакцию выполняют на обезжиренных предметных стеклах, на которые наносят 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 60° агара.
Для постановки реакции лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко», он полностью растворяется и сразу не нужно фильтровать. При употреблении других сортов агар-агара необходима тщательная фильтрация.
После застывания агара в нем делают лунки при помощи тонкостенной металлической или стеклянной трубочки с внутренним диаметром 4—5 мм, располагая их согласно трафарету.
Для постановки реакции от крупных животных берут кусочки головного мозга: аммонов рог, кору полушарий, мозжечок, продолговатый мозг; от мелких животных (крысы, суслики, морские свинки, хомяки и др.) рекомендуется проверять в реакции три каких-либо отдела мозга. От мышей берут весь головной мозг, растирают в фарфоровой ступке пестиком и небольшое количество помещают в луночку для антигена.
Остальные четыре луночки заполняют преципитирующим глобулином в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.
Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят одновременно на отдельном стекле с использованием того же агара, по тому же трафарету.
После того как ингредиенты реакции помещены в соответствующие луночки, предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой) в термостат на 6 часов при 37—38°. Затем чашки оставляют при комнатной температуре еще на 18 часов.
Учет реакции проводят через 3, 6 и 24 часа. Часто положительная реакция отмечается уже через 3 часа и соответствует образованию одной, реже 2—3 линий преципитации между ближайшими лунками, содержащими антиген и специфический глобулин. Окончательно реакцию учитывают через 24 часа.
Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату (фильтровальная бумага).
Реакция преципитации в агаре — это чувствительный серологический тест, позволяющий быстро и с минимальной затратой реагентов проводить исследование.
Объем используемых ингредиентов 0,02 мл.
При отрицательных показаниях реакции преципитации ставят биопробу.
Реакция иммунофлуоресценции основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-2 Микмед-2-11, ЛЮМАМ и др.) вирусного антигена, вступившего в реакцию со специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующим красителем.
Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженного головного мозга. Отпечатки готовят, как и для микроскопического исследования. От каждого кусочка мозга готовят не менее 4 препаратов. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного.
После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение четырех часов при температуре 2—4°. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном на препараты наносят несколько капель конъюгата (флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин) в рабочем разведении. Затем их помещают во влажную камеру (чашки Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20—30 минут при температуре 25°.
После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (pH 7,2—7,4) в течение часа, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и исследуют.
Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло. В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии мозговая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым светом. Антиген вируса бешенства выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до 15—20 мк в диаметре.
В контрольном препарате желто-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечают.
По интенсивности свечения результаты оценивают:
+ + + + яркая, сверкающая желто-зеленая люмине¬сценция:
+ + + отчетливо выраженная, достаточно яркая зеленая люминесценция:
++ неяркая люминесценция зеленого цвета;
+ слабая люминесценция, обнаруживаемая в крупных включениях, зелено-серого цвета; — отсутствие специфической люминесценции.
При исследовании с помощью метода флуоресцирующих антител диагноз бешенства считают установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленоватым свечением. В контроле подобных образований не должно быть. При отсутствии положительной флуоресценции необходимо ставить биопробу на молодых белых мышах.
Метод флуоресцирующих антител высокочувствителен и позволяет получить ответ на исследование материала в день его поступления в лабораторию.
Биопробу на бешенство ставят, если получен отрицательный результат: при микроскопическом исследовании (тельца Бабеша— Негри не обнаружены), при серологических реакциях (специфический рабический антиген не выявлен), а также при выявлении атипичных включений.
Биологическую пробу проводят на белых мышах или кроликах. Подопытным животным вводят 10%-ную суспензию, полученную из исследуемого мозга и физиологического раствора или мясопептонного бульона, pH 7,2—7,4. Для приготовления суспензии используют те же участки головного мозга, из которых брали материал для микроскопического и серологического исследований.
Вырезанные участки головного мозга помещают в стерильную пробирку, взвешивают, тщательно растирают в ступке пестиком,, добавляют физиологический раствор или мясопептонный бульон из расчета получения 10%-ной суспензии. Полученную суспензию отстаивают 10 минут и используют надосадочную жидкость.
Если патологический материал был загрязнен, то надосадочную жидкость сливают в другой сосуд (пробирку) и на 1 мл жидкости добавляют по 500—1000 ЕД пенициллина и стрептомицина, после чего отстаивают еще 30 минут при комнатной температуре и используют для заражения. Суспензию готовят в стерильных условиях и при строгом выполнении правил личной профилактики.
Заражают белых мышей весом 8—10 г. Для каждого исследования берут по 6 мышей, из которых трем суспензию вводят в головной мозг, а другим трем подкожно. При заражении в мозг иглу вводят в точке за линией, соединяющей задние углы глаз, и немного в стороне от линии, проходящей посередине головы. Операционное поле протирают спиртом. Суспензию вводят в дозе 0,03 мл. Чтобы игла не проникала глубоко в мозг, на нее надевают ограничитель — небольшой кусочек резиновой трубки, который укрепляют на расстоянии 2—3 мм от конца иглы. При подкожном заражении суспензию вводят в область кончика носа (в верхнюю губу) в дозе 0,05 мл. На месте введения суспензии образуется небольшая припухлость. Зараженных мышей помещают в стеклянные банки и наблюдают за ними в течение 20—25 дней. При положительном результате у мышей обычно на 7—15-й день развиваются симптомы паралитического бешенства.
Вначале отмечают вялость, взъерошенность шерсти и своеобразную горбатость, а также нарушение координации движений. Затем наступает паралич задних конечностей, а позднее — передних, переходящих в общий паралич, заканчивающийся смертью. Продолжительность болезни 2—3 суток.
С развитием общего паралича мышей умерщвляют эфиром или хлороформом. У павших и убитых мышей вскрывают черепную полость, делают засев, из мозга на питательные среды, после чего извлекают головной мозг, из которого готовят препараты для микроскопического и иммунобиологических исследований.
Если в течение 20—25 дней симптомы бешенства у зараженных мышей не проявились, их уничтожают. Банки, в которых они находились, тщательно дезинфицируют.
При постановке биологической пробы на кроликах берут двух животных весом не менее 1,5 кг. Суспензию им вводят в мозг в дозе 0,2 мл. Если материал загрязнен, его обрабатывают, как указано выше, и суспензию вводят еще двум кроликам внутримышечно в дозе 2 мл.
При положительном результате биологической пробы кролики заболевают через 16—21 день. Бешенство у кроликов протекает в тихой, паралитической форме со смертельным исходом. У павших кроликов извлекают головной мозг, и дальнейшее исследование проводят так же, как и при заражении мышей. Наблюдают за кроликами в течение 45—50 дней. По истечении указанного срока незаболевших кроликов уничтожают. Клетки; в которых находились подопытные животные, дезинфицируют.
Гистологическое исследование. Пересылать материал (голову животного) лучше всего с посыльным. Если это невозможно, то материал помещают в водонепроницаемый металлический ящик с плотно пригнанной крышкой, который необходимо поместить в другой, более вместительный, заполнив промежуток между стенками льдом.
В сопроводительной записке указывают вид и породу животного, находилось ли оно в контакте с другими животными, было ли животное убито или оно пало, способ убоя, .находилось ли животное под наблюдением ветеринарного врача до момента смерти и какое время, наблюдаемые симптомы, данные о вакцинации против бешенства.
Вскрытие трупа, извлечение мозга и другие работы проводят при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, работа в перчатках, защита глаз очками, на рот и нос надевается марлевая повязка).
Извлечение мозга. После закрепления головы животного секционным ножом по средней линии разрезают кожу, фасции и мышцы головы. Разрез начинают на уровне глаз и ведут кзади к основанию черепа, обнажая кость. Кости черепа распиливают хирургической пилой. Два продольных распила проводят от большого затылочного отверстия кпереди с обеих сторон, а затем соединяют их поперечным распилом на лобной кости непосредственно на уровне глаз. Выпиленный кусок кости приподнимают костными щипцами или долотом. Рассекают мозговую оболочку и мозжечковый намет, отделяющий мозжечок от большого мозга. Этим же скальпелем отсекают мозг на уровне продолговатого мозга, пересекая черепно-мозговые нервы и ножку гипофиза. Весь мозг извлекают из черепа и помещают в кювет. Все операции выполняют стерильными инструментами.
Обнажить аммонов рог (наиболее подходящий участок для обнаружения телец Негри) нетрудно. На дорсальной поверхности полушария мозга стерильными ножницами проводят продольный разрез, идущий на 2 см латеральнее средней линии. Разрез начи¬нают от затылочного полюса и ведут кпереди на протяжении 3— 5 см. В глубину разрез проникает до бокового желудочка. Разводя края мозгового вещества в месте разреза, можно увидеть аммонов рог — полуцилиндрическое белое блестящее тело* выбухающее на нижневнутренней стороне желудочка. Он имеет спиральный кон¬тур, а на разрезе характерную закругленную поверхность.
Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога, коры больших полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и нервных узлов и фиксируют их в смеси Буен—Дюбоско—Бразиль, состоящей из 40%-ного формалина (500 мл), 96%-ного этилового спирта (1100 мл), дистиллированной воды (100 мл), ледяной уксусной кислоты (120 мл), пикриновой кислоты (8 г).
Сразу после фиксации без промывки материал обезвоживают и кусочки заливают в парафин.
Окрашивают гистологические срезы по методу Manna, Sellersa или по методу Туревича.
Окраска по Manny позволяет тонко отдифференцировать тельца Бабеша—Негри.
Депарафинированные срезы доводят до воды, а затем окрашивают в смеси, состоящей из 1%-ного раствора метилового (не метиленового!) синего (18 мл), 1%-ного водного раствора эозина (23 мл) и дистиллированной воды (49 мл) в течение 18—24 часов при комнатной температуре, затем промывают водой, быстро обрабатывают абсолютным спиртом и дифференцируют до порозовения (около 10 минут) спиртовым раствором едкого натрия, состоящим из 1,5%-ного раствора едкого натрия (1 мл) и абсолютного спирта (30 мл). Далее срезы промывают водой до приобретения ими бледно-голубой окраски, обезвоживают в спиртах, обрабатывают карбол-ксилолом и заключают в бальзам.
Результат окраски: тельца Бабеша—Негри — ярко-красные, ядрышки нейронов — фиолетово-красные, хроматин — синий, цитоплазма — темно-синяя, эритроциты — розовые.
Окраска по Sellersу. Реактивы: первый — метиленовый синий (10 г), метиловый спирт (без следов ацетона) (1000 мл); второй — основной фуксин (5 г), метиловый спирт (без ацетона) (500 мл). Пользуются препаратами с высоким содержанием красителей (метиленовый синий не менее 85%, фуксин не менее 92%).
После освобождения от парафина срезы окрашивают погружением в смесь, состоящую из основного раствора фуксина (6 мм), основного раствора метиленового синего (10 мл) и абсолютного метилового спирта (50 мл). Время окрашивания (2—10 минут) зависит от толщины среза. Промывают водопроводной водой, просушивают фильтровальной бумагой, не пользуясь спиртом, и заключают в бальзам.
Результаты окраски: тельца Бабеша—Негри каштаново-красного цвета имеют вид вакуолей в сине-фиолетовом нейроне. Внутренние структуры окрашиваются в темно-синий цвет подобно ядрышкам нервных клеток. Эритроциты медно-красные, чем отчетливо отличаются от телец Негри.
Патологогистологическая диагностика бешенства состоит в обнаружении признаков острого энцефаломиелита: преимущественно вокруг мелких вен обнаруживают периваскулярные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоидных клеток, имеющих вид клеточных муфт. В ганглиозных клетках головного мозга могут быть хроматолиз, вакуолизация и острое набухание клеток, а также гибель отдельных клеток. В области поврежденных нервных клеток довольно постоянна пролиферативная реакция глии, принижающая форму истинной нейронофагии с последующим замещением нервных клеток элементами размножившейся глии. Такое скопление клеток пролиферата на месте распавшейся нервной клетки носит название узелка бешенства — на срезе иногда можно проследить процесс развития узелка.
Достаточно выраженные изменения, аналогичные описанным, наблюдаются в ткани нервных узлов и особенно в верхнешейных узлах. При гистологическом исследовании находят обширные клеточные инфильтраты в ретикулярной строме узлов и адвентиции сосудов, а также явления истинной нейронофагии. Клеточные инфильтраты, как и в головном мозге, состоят из лимфоидных и плазматических клеток. Также организуются узелки бешенства. Благодаря сохранившейся капсуле нервных клеток узелки бешенства имеют хорошо выраженные границы.
Специфическим для бешенства является наличие в цитоплазме нервных клеток телец Бабеша—Негри. Если животное погибло от бешенства, то тельца Бабеша—Негри обнаруживаются сравнительно легко. Если животное было убито, то смерть его могла наступить до появления специфических изменений. По форме и величине тельца Негри весьма разнообразны, находятся в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде многочисленных или одиночных экземпляров. Чаще тельца Бабеша—Негри обнаруживают в крупных ганглиозных клетках, причем клетки, содержащие их, не имеют выраженных признаков дегенерации.
Тельца Бабеша—Негри имеют сложную структуру. Основное вещество их ацидофильно, поэтому при окрашивании с применением основного фуксина и эозина тельца приобретают цвет от розового до алого. Наиболее характерным признаком телец Негри является их внутреннее строение, оно и считается необходимым критерием для постановки положительного диагноза на бешенство. Для целей диагностики важно установить наличие темно-синих гранул, независимо от числа и положения их в субстанции тельца. Исследовать необходимо не менее 6 препаратов, взятых из различных отделов головного мозга и нервных узлов.
При гистологическом исследовании нередко обнаруживают другие включения, которые из-за ряда сходных признаков иногда принимают за тельца Негри. Следует иметь в виду, что в мозгу здоровых кошек и белых мышей иногда содержатся неспецифические ацидофильные тельца-включения. Эти тельца можно отдифференцировать от телец Негри по отсутствию внутренних гранул и гомогенности основной субстанции. Небольшие ацидофильные внутрицитоплазматические тельца-включения, не имеющие внутренней структуры, встречаются у животных, убитых в ранних стадиях бешенства. Вот почему рекомендуется содержать животных, находящихся под подозрением, на карантине до их естественной смерти, а не убивать их сразу же.
| 
