ОЦЕНКА МУТАГЕННЫХ СВОЙСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
СОСТАВИТЕЛИ:
докт. мед. наук, профессор А.Д. Дурнев, докт. биол. наук, профессор Ю.А.Ревазова,
канд. мед. наук О.Л. Верстакова, докт. мед. наук, профессор Т.А. Гуськова, докт. мед. наук, профессор B.C. Журков,
канд. биол. наук Ф.И. Ингель, канд. мед. наук Л.П. Сычева, канд. биол. наук Т.Б. Танирбергнов,
канд. биол. наук Л.В. Хрипач, Т.Е. Цуцман, канд. мед. наук В.В. Юрченко.
РЕЦЕНЗЕНТЫ:
докт. мед. наук, профессора А.Г. Рудакова и член-корр. РАМН, профессора В.П. Фисенко.
Под редакцией:
докт. мед. наук Н.Р. Дядищев, канд. биол. наук Л.В. Михина, канд. биол. наук А.И. Марченко, канд. мед. наук Р.Д. Сюбаев
1.Введение
Исследование мутагенности новых фармакологических средств и вспомогательных компонентов лекарственных форм проводится на этапе доклинического изучения безопасности их применения. Эта работа предусматривает оценку способности лекарственных средств к индукции разных типов мутаций в зародышевых и соматических клетках и делает необходимым использование для оценки мутагенных свойств лекарств комплекса методов, выполняемых на разных тест-объектах. Опыт работы по тестированию лекарств, накопленный различными группами исследователей с момента выхода первой редакции "Методических рекомендаций по оценке мутагенности новых лекарственных средств" (1981), показывает, что целесообразным представляется использование этапного подхода, сводящегося к следующему: на уровне доклини-ческих испытаний следует использовать минимальный набор методов для оценки лекарств на мутагенность, а именно - 1) учет хромосомных аберраций или микроядер в клетках костного мозга млекопитающих и 2) учет генных мутаций с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов или дро-зофилы. При условии получения отрицательных результатов препарат может быть допущен к первой фазе клинических испытаний. Перед второй фазой клинических испытаний необходимо провести изучение способности лекарственного препарата индуцировать мутации в зародышевых клетках мышей (доминантный летальный тест). В случае отсутствия мутагенной активности можно продолжить клинические испытания. Если в отдельных тестах получены неоднозначные, но воспроизводимые результаты, то на заключительных этапах клинических испытаний следует провести исследование уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови леченных больных. Дополнения и уточнения регламента выполнения рекомендованных методов и трактовка экспериментальных результатов описаны в соответствующих разделах.
Изучение генетической активности лекарственных средств требует профессиональной подготовки.
Данные методические рекомендации описывают комплексную систему проверки генетической активности новых лекарственных средств, но не являются пособием для освоения методов. Последние в должном объеме можно освоить только в результате стажировки в лабораториях соответствующего профиля.
2. ОБЩИЕ ПОДХОДЫ
2.1. Принципы отбора фармакологических средств для испытания на мутагенную активность
Тестированию на мутагенную активность подвергаются новые оригинальные фармакологические средства, созданные химическими, биотехнологическими, генноинженерными и иными способами, включая полученные из сырья природного происхождения. Новые фиксированные комбинации фармакологических средств, планируемые для широкого клинического применения, при структурном сходстве компонентов комбинации с известными канцерогенами, мутагенами или их метаболитами также подвергаются испытанию. Для анализа структурного сходства используется, во-первых, представительная база данных о мутагенных свойствах широкого круга химических соединений, и, во-вторых, специальные компьютерные программы [1,2].
2.2. Пути введения фармакологического средства, выбор доз, объекты исследования
Пути введения исследуемого фармакологического средства должны соответствовать планируемому способу приема лекарства человеком.
Если предполагается возможность энтерального и парентерального введения, можно использовать внутрибрюшинный, подкожный или внутримышечный способы введения. Фарма- кологические средства перорального применения изучают при внутрижелудочном пути введения. Изучение мутагенной активности ингаляционных анестетиков, мазей и т.п. проводят в условиях предполагаемого применения (ингаляционное, накожное) и при парэнтеральном введении.
Исследуемые фармакологические средства растворяют в дистиллированной воде или физиологическом растворе. Водонерастворимые препараты вводят с Твином-80 или используют растворители (этиловый спирт, диметилсульфоксид в конечной концентрации до 5 %); для перорального введения порошкообразных лекарств можно использовать растительное масло или 1% водный раствор крахмала.
Оптимальный объем вводимых растворов фармакологических средств и соответствующих растворителей (для контрольных групп животных) должен составлять при пероральном и внутрибрюшинном способах введения не более 0,5 мл и при внутримышечном - не более 0,2 мл.
Выбор доз для исследований определяется на основе результатов оценки острой токсичности и терапевтической эффективностью,фармакологического средства. Используются две дозы: одна соответствует предполагаемой суточной те- рапевтической дозе для человека, пересчитанной на поверхность тела экспериментального животного [3], а вторая выбирается на основе данных по острой токсичности и составляет 1/10 - 1/5 LDJO для используемого вида млекопитающих.
Проведение экспериментов in vivo диктует необходимость применения генетически однородных животных. При этом использование мышей предпочтительнее, однако не исключено применение других видов животных (половозрелых самцов и самок).
3. МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ МУТАГЕННОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
3.1. Учет аберраций хромосом в клетках костного мозга млекопитающих
3.1.1. Термины и определения
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Аберрации хромосомного типа- структурные нарушения на уровне идентичных локусов обеих хроматид, выявляемые как парные фрагменты и хромосомные обмены.
Аберрации хроматидного типа - структурные нарушения на уровне одной хроматиды, выявляемые как одиночные фрагменты или хроматидные обмены.
Ахроматические пробелы (гепы) - определяемые визуально нарушения целостности окраски хроматиды, не превышающие по размеру ее ширину и не сопровождающиеся сдвигом дистального участка относительно ее оси.
3.1.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цито-генетической активности фармакологических средств в клетках костного мозга млекопитающих.
В основе метода лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках на стадии метафазы. Клетки костного мозга характеризуются высоким уровнем митотической активности, спонтанная частота клеток с хромосомными повреждениями, включая гепы, составляет 1-2,5% [4].
3.1.3. Процедура тестирования
3.1.3.1. Лабораторные животные.
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище.
3.1.3.2. Проведение эксперимента.
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей Суточной терапевтической для человека и в субтоксической дозе, вводят однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 часа после введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на протяжении 4-5 суток. Фиксацию клеточного материала осуществляют через 6 и/или 24 часа после последнего введения в зависимости от фармакокинетических особенностей испытуемого препарата [5].
3.1.3.3. Контроли
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать циклофосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетической активностью.
Негативным контролем является используемый растворитель.
3.1.3.4. Приготовление цитогенетических препаратов
Методика выделения клеток костного мозга и приготовления препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и ранее опубликованных методических рекомендациях [4-5]. Полученные препараты (два стекла от каждого животного) шифруют и подвергают микроскопическому цитогенетическому анализу.
3.1.3.5. Микроскопический анализ.
Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Анализу подвергаются округлые метафазные пластинки без наложений хромосом с модальным числом 40 - для мышей, 42 --для крыс. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом.
3.1.4. Оценка результатов
Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытных сериях эксперимента. Сравнение долей клеток с гепами и разрывами по центромере Следует рассматривать в качестве дополнительных критериев цитогенетической активности исследуемого препарата.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым рекомендациям [6].
Результаты документируются согласно таблице 1.
Таблица 1. Итоговая таблица результатов оценки цитогенетической активности вещества в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих
Условия эксперимента
| Мышь
№
| Кол-во исследованных клеток
| Кол-во аберраций
| Клетки с множественными аберрациями
| Пробелы, кол-во /клетки
(%)
| Доля поврежденных клеток
(%)
| Одиночные фрагменты
| Парные фрагменты
| Обмены
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Доказательством цитогенетической активности исследуемого препарата является статистически значимое превышение доли аберрантных клеток в опыте по сравнению с негативным контролем.
3.1.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенети ческой активности вещества в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:
вид________линия_____пол__масса___
питомник_________________________
дата получения______________________
количество________________________
Вещество:
название_________________________
формула, физико-химические свойства_________
откуда получено_____________________
растворитель
позитивный контроль__________________
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогенная активность и т.д.)
Схема эксперимента:
дата проведения__________________________________
путь введения__________дозы__________________
длительность и кратность введения __________
группы___________________________
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.2. Учет микроядер в клетках млекопитающих
3.2.1. Термины и определения.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии ана-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественые микроядра в цитоплазме.
3.2.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цито-генетической активности фармакологических средств в поли- хроматофильных эритроцитах костного мозга млекопитающих.
Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.
Спонтанная частота клеток с микроядрами составляет 0,1-0,2% [7].
3.2.3. Процедура тестирования
3.2.3.1. Лабораторные животные.
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 6 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище.
3.2.3.2. Проведение эксперимента.
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека и в субтоксической дозе, вводят однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 часа после введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на протяжении 4-5 суток. Фиксацию клеточного материала осуществляют через 6 и/или 24 часа после последнего введения в зависимости от фармакокинетических особенностей испытуемого препарата [5,7].
3.2.3.3. Контроли
Негативным контролем является используемый растворитель.
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать циклофосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетической активностью.
3.2.3.4. Приготовление цитогенетических препаратов
Методика выделения клеток и приготовления препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и методических рекомендациях [5,7]. Полученные препараты (два стекла от каждого животного) шифруют и подвергают микроскопическому цитогенетическому анализу.
3.2.3.5. Микроскопический анализ.
Анализируют 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного, соотношение нормо- и полихроматофильных эритроцитов определяют при подсчете 500 эритроцитов.
3.2.4. Оценка результатов. Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных. Результаты опытов представляют в виде таблицы 2.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым рекомендациям [6].
Таблица 2. Результаты оценки цитогенетической активности вещества в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга млекопитающих
Группа
(вещество, доза)
| Мышь N
| Кол-во ПХЭ с микроядрами
на 1000 ПХЭ
| Доля ПХЭ от всех эритроцитов
| на каждую мышь
| на группу в целом
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3.2.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенетической активности вещества в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:
вид_________линия_____пол_______масса______
питомник___________________________
дата получения__________________________
количество__________________________
Вещество:
название_____________
формула, физико-химические свойства_________
откуда получено_____________________
растворитель___________________
позитивный контроль____________
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогенная активность и т.д.)
Схема эксперимента:
дата проведения__________________
путь введения__________дозы_________
длительность и кратность введения __________
группы______________
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.3. Мутационный тест на Salmonella typhimurium (тест Эймса)
3.3.1. Термины и определения
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма.
Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации типа замены пар оснований в молекуле ДНК. В данном тесте эти мутации могут происходить или в сайте исходной мутации, или в другом сайте хромосомы.
Мутагены, индуцирующие мутации типа сдвига рамки считывания - агенты, вызывающие вставку или делению одной или нескольких пар оснований в молекуле ДНК.
3.3.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium.
Фармакологические средства с выраженной антибактериальной активностью изучать в тесте Эймса нецелесообразно.
Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации или без метаболической активации. После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем).
Если тестируемое соединение и/или его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидинзависимых штаммов Salmonella typhimuri-um [8,9].
3.3.3. Процедура тестирования
3.3.3.1. Бактерии
В качестве тестерных организмов используются штаммы Salmonella typhimurium. Минимальный набор состоит из штаммов ТА 97, ТА 98 и ТА 100. При необходимости могут использоваться и другие виды и штаммы микрорганизмов.
Каждый штамм должен быть проверен на ауксотрофность по гистидину, чувствительность к кристаллическому фиолетовому и устойчивость к ампициллину. Тестерные штаммы должны иметь уровень спонтанных ревертантов в пределах ожидаемого на основании литературных данных.
3.3.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до забоя) [10].
3.3.3.3. Изучаемые дозы (концентрации)
Максимальная доза тестируемого соединения определяется его токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого соединения может изменяться при использовании экзогенной метаболической активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная доза может быть в пределах 1000-5000 мкг/чашку. Для тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная доза должна подавлять рост бактерий не более, чем на 50%, что определяется либо по уменьшению количества спонтанных ревертантов, либо по подавлению роста бактериального газона. В любом случае должно проверяться не менее 5 различных доз тестируемого соединения, различающихся например в 10 раз.
3.3.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или диметилсульфоксид, а при необходимости и другие растворители.
Позитивные контроли должны быть специфичны для каждого тестерного штамма. Позитивный контроль для вариантов с метаболической активацией должен соответствовать типу используемой системы экзогенной метаболической активации.
3.3.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами описаны в литературе.
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией.
В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят соответствующий объем растворителя.
3.3.4. Данные и их представление
3.3.4.1. Обработка результатов
Данные должны быть представлены в виде количества ревертантных колоний на чашку. Как для тестируемого соединения, так и позитивных и негативных контролей указывается количество колоний для каждой чашки, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение. Если ни в одном из вариантов на данном штамме (штаммах) не получено статистически значимых результатов, эксперимент прекращают. В случае обнаружения позитивного результата опыт повторяют с целью подтверждения эффекта, причем работу ведут только на том штамме (штаммах), на котором был выявлен эффект. Если максимальный эффект зарегистрирован на одной из промежуточных доз (такая ситуация возможна при работе с фармакологическими средствами, обладающими бактерицидными свойствами), прибегают к дроблению доз. При этом за среднюю точку на шкале доз испытуемого вещества принимают дозу, на которой был выявлен максимальный эффект. В опыт вводят еще 4 варианта: дозы в 2 и 5 раз меньше и больше средней дозы.
Если при проведении повторного опыта эффект не обнаруживается, проводится еще один дополнительный опыт, результат которого сравнивают с первыми двумя экспериментами. Заключение о наличии или отсутствии мутагенной активности испытуемого соединения делают на основании двух опытов с совпадающими результатами.
Для оценки результатов тестирования могут использоваться соответствующие статистические методы, например метод попарных сравнений Даннета [6].
3.3.4.2. Оценка результатов
Критериями позитивного результата являются или статистически достоверное зависимое от дозы увеличение коли чества ревертантов, или воспроизводимый и статистически достоверный позитивный ответ по крайней мере для одной экспериментальной точки.
Тестируемое соединение, не вызывающее статистически достоверного зависимого от дозы увеличения количества, ревертантов или воспроизводимого и статистически достоверного позитивного ответа для какой-либо экспериментальной точки, рассматривается как немутагенное в данном тесте.
Отчет должен включать следующую информацию:
- бактерии: использованные штаммы;
- условия проведения теста: уровни доз и обоснование выбора доз, количество чашек на экспериментальную точку, токсичность, состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика обработки, позитивные и негативные контроли;
- индивидуальные результаты для каждой культуры;
- среднее количество ревертантных колоний на чашку;
- стандартное отклонение;
- отношения доза-эффект (где возможно).
3.3.4.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то,> что тестируемое соединение индуцирует генные мутации типа' замены пар оснований или сдвига рамки считывания у данного микроорганизма. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение не мутагенно для использованных штаммов Salmonella typhimurium.
3.3.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности вещества в тесте по учету генных мутаций у бактерий
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы:
вид______________штаммы_________
Вещество:
название_________________________
формула, физико-химические свойства______
откуда получено_______________________
растворитель__________________
позитивный контроль____________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения (начало, окончание, отдельные эксперименты)_______________
способ обработки_______ дозы________
количество повторностей, количество чашек на дозу_______________
система метаболической активации_________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.4. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы
3.4.1. Термины и определения
Летальная мутация - изменение в геноме, проявление которого приводит к смерти его носителя.
Рецессивная мутация - изменение в геноме, которое проявляется в условиях гомозиготности или гемизиготности. Сцепленные с полом гены присутствуют в половых (X или Y) хромосомах. Обсуждаемый метод определяет мутационные события в Х-хромосоме.
3.4.2. Цель исследования и принцип метода
С помощью данного метода проводят оценку способности испытуемого вещества и продуктов его метаболизма индуцировать генные мутации в зародышевых клетках дрозофилы. Рекомендуемый метод, называемый Меллер-5, основан на индукции исследуемыми лекарствами рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме самцов дикого типа линии D-32. Эти мутации передаются через самок F, самцам второго поколения, не доживающим до стадии имаго.
3.4.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в соответствующих руководствах [11].
3.4.3.1. Используемые линии дрозофилы
Для опытов по учету рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) требуется линия дикого типа с хорошо изученным спонтанным фоном мутабильности, например, Canton-S или 0-32, а в качестве тестерной линии лучше всего использовать линию BASC. В Х-хромосоме мух этой линии имеются 2 инверсии - sc8 и d49, которые полностью исключают возможность кроссинговера между половыми хромосомами, но не нарушают жизнеспособности дрозофилы [11]. Фенотипическими маркерами служат мутации Apricot - абрикосовые глаза и Ваг - полосковидные глаза. В подобного рода экспериментах можно пользоваться также тестерной линией CIB.
3.4.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют два основные способа введения испытуемых фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный и пероральный (с пищей). Чаще всего используют последний, при введении соединения в корм. В этом случае целесообразно использовать стеклянные пористые фильтры, погруженные в бюксы с веществами, растворенными в 1- 5,% сахарном сиропе в исследуемых концентрациях. Если препарат нерастворим в воде, можно (при обязательном применении соответствующих контролей с растворителями) растворить его в этиловом спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация этих растворителей в сахарном корме не превышала 2 %. Допускается внесение фармакологических средств непосредственно в корм. Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах. Расчет доз при ингаляционном введении производят на объем эксикатора, а при лероральном - на объем корма.
В зависимости от токсичности фармакологического средства длительность экспозиций может колебаться от нескольку часов до нескольких дней (обычно экспозиция составляет 48-72 часа). Комбинация различных концентраций и экспозиций позволяет ориентировочно определять количество ("дозу") фармакологического средства, вызывающую примерно 50% стерильность самцов. Эту "дозу" принимают за максимальную, которую используют в эксперименте. Снижение "дозы" необходимо только в случае испытаний фармакологических средств, обладающих выраженным стерилизующим аффектом.
3.4.3.3. Проведение эксперимента
После обработки изучаемым фармакологическим средством самцов линии D-32 скрещивают с виргинными самками тестерной линии BASC (5 самцов ' 10 самок). После начала вылета мух первого поколения (F1) отбирают виргинных гетерозиготных самок и индивидуально скрещивают их с самцами F1.
После вылета второго поколения (F2), каждая культура просматривается визуально с целью обнаружения таких, в которых отсутствуют самцы дикого фенотипа (с красными глазами). Общее количество культуральных пробирок определяет число проанализированных Х-хромосом самцов, подвергшихся действию изучаемых соединений. Пробирки, в которых отсутствуют самцы дикого типа, отмечают как "летали". Постановка контролей обязательна [5].
3.4.4. Данные и их представление
Результаты опытов представляют в виде таблицы 3.
Таблица 3. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций на дрозофиле
Концентрация
| Экспозиция
| Кол-во изученных культур
F2
| Кол-во нефертильных самцов
F2
| Кол-во рецессивных летальных мутаций
| Уровень значимости
| кол-во
| %
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Частоту рецессивных леталей оценивают как отношение числа культур второго поколения без самцов дикого фенотипа к общему числу культур. Всего необходимо поставить не менее 1000 культур F2 на одну экспериментальную точку.
Для оценки значимости превышения частоты рецессивных леталей в опыте над контролем следует применять точный критерий Фишера для таблиц сопряженности 2x2.
Различие между опытом и контролем считаются значимыми при р < 0,01 [6].
3.4.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности вещества в тесте на индукцию рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы:__________________
Вещество:
название_________________________
формула, физико-химические свойства_________
производитель____________________________
растворитель_______________________
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогенная активность и т.д.)
Схема эксперимента:
дата проведения__________________
способ обработки____ концентрации_________
длительность обработки_________________
группы___________________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.5. Учет соматической рекомбинации (мозаицизма) у дрозофилы
3.5.1. Термины и определения
Под соматической рекомбинацией понимают обмен генетическим материалом между гомологичными хромосомами соматических клеток в митозе, приводящий к образованию мозаичных особей. При использовании в качестве маркеров рецессивных генов возможно выявление генных мутаций, делеций, митотических рекомбинаций и генных конверсии.
3.5.2. Цель исследования и принцип метода
Целью данного метода является интегральное выявление рекомбинационных и других мутационных событий, индуцируемых лекарственным веществом или его метаболитами в соматических клетках личинок дрозофилы. В основе метода лежит учет мозаичных пятен, возникающих у мух тестерных линий в результате комплексного нарушения генотипа: митотической рекомбинации, потери хромосом и/или их фрагментов, транслокаций, делеций и генных мутаций. В качестве маркеров возможно использование генов "у" и "sn3" в трансположении [12].
3.5.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в соответствующих руководствах [11].
3.5.3.1. Используемые линии дрозофилы
Для учета соматического мозаицизма в данной тест-системе необходимо поддержание следующих тестерных линий дрозофилы:
линия 1 - yellow - генотип у/у (у - рецессивный ген, обусловливающий развитие желтой окраски тела и щетинок);
линия 2 - w, sn3 - генотип w sn3/Y (w - white - белая окраска глаз, sn3- singed3- извитая скрученная форма щетинок; оба гена рецессивные);
Спонтанный уровень мутаций и рекомбинаций невысок и колеблется у разных линий в пределах от 0,3 до 1,1 %.
3.5.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют один из двух способов введения испытуемых фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный или пероральный (с кормом). Если препарат нерастворим в воде, можно (при обязательной постановке соответствующих контролей) растворить его в этиловом спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация этих растворителей в испытуемом растворе 2 %. В любом случае в культуру с кормом вносят 200 мкл тестируемого раствора. Возможно распыление нерастворимых в воде соединений по поверхности питательной среды. Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах, в этом случае расчет доз производят на объем эксикатора.
Токсичность фармакологических средств устанавливают по выживаемости самок F1, которая на максимальной из использованных концентраций не должна быть меньше 50%. Всего в эксперименте определяют эффект 3 различных концентраций фармакологического средства. В зависимости от токсичности фармакологического средства длительность экспозиций может колебаться от нескольких часов до нескольких дней (обычно экспозиция составляет 48-72 часа).
3.5.3.3. Проведение экспериментов
Девственных самок в количестве 10 особей помещают в пробирку, содержащую стандартную питательную среду вместе с 5 самцами. Через 48-72 часа родителей пересаживают в пробирки со свежей питательной средой, а в прежние пробирки вносят растворы испытуемых фармакологических средств.
Просмотр вылетевших особей начинают с 9-10 дня после начала эксперимента и продолжают до начала вылета следующего поколения. Просмотр проводят под бинокулярным стереоскопическим микроскопом в отраженном свете.
При скрещивании самок линии 1 с самцами линии 2 у гетерозиготных самок первого поколения, имеющих генотип у+/ +w sn3, регистрируют мутантные щетинки (макрохеты на голове, тораксе и скутеллюме) фенотипа yellow или singed. В протоколе регистрируют общее число просмотренных самок, число самок с одиночными (у, sn3) и двойными (у sn3) пятнами [12].
3.5.4. Данные и их представление
Результаты экспериментов представляют в виде таблицы 4.
Таблица 4.Учет соматического мозаицизма при использовании маркеров у, w и sn3
Препарат, концентрация /экспозиция
| Общее число просмотренных самок
| Число самок с мутациями
| Пятен "sn3"
| Пятен "y"
| Пятен
"y sn3"
| Всего пятен
| %+(-)m
|
|
|
|
|
|
|
|
m= 1/V N, где N - число просмотренных особей Статистическую обработку результатов проводят с использованием х2 критерия, сравнивая частоту появления особей с пятнами в контрольных и опытных сериях [3].
3.5.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности вещества в тесте на индукцию соматического мозаицизма у дрозофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы, условия скрещивания:
Возраст родителей на момент скрещивания:
Вещество:
название_____________________________
формула, физико-химические свойства____________________
производитель______________
растворитель_________________
Анализ данных литературы: (структура, мутагенная и канцерогеная активность)
Схема эксперимента:
дата проведения______________________
способ обработки________________________
концентрации_______________________
максимальный возраст личинок на момент обработки_______
группы____________________________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.6. Метод учета доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей
3.6.1. Термины и определения
Доминантные летальные мутации генетические измене ния, индуцированные в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели первое поколение потомков на эмбрио нальных стадиях развития. Большая часть доминантных леталеи представляет собой численные и структурные аберрации хромосом, частично они могут быть представлены генными мутациями.
3.6.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление влияния исследуемого препарата на генетические структуры зародышевых клеток. Мутагенный эффект проявляется в виде повышенной эмбриональной смертности. Если яйцеклетка оплодотворена сперматозоидом, несущим доминантную леталь, то смерть развивающегося эмбриона может произойти как до, так и после имплантации. Для оценки мутагенных свойств фармакологических средств учитывают постимплантационную смертность.
3.6.3. Процедура тестирования
Обычная схема проведения эксперимента включает обработку фармакологическим средством самцов с последующим спариванием их с интактными самками [4,13,14].
3.6.3.1. Лабораторные животные
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе. Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище.
3.6.3.2. Проведение эксперимента
Для каждого варианта опыта и контроля (понедельного) следует использовать животных приблизительно одного срока рождения. Самок в течение 2-3 недель после привоза не рекомендуется брать в опыт для исключения неконтролируемых беременностей. Каждая группа самцов, обрабатываемых фармакологическим средством, должна быть увеличена на 3- 5 животных для использования их в случае не предусмотренной гибели в ходе опыта.
Для выявления возможного мутагенного эффекта фармакологическое средство исследуется в дозах 1/10 ил1/2 LD50 при однократном введении. Применяемые дозы не должны снижать фертильность более чем 50 %. В противном случае их уменьшают и повторяют эксперимент. Исследование проводят в течение 3 недель на постмейотических стадиях сперматогенеза. На каждую дозу и контроль берут не менее И 5 самцов. Сразу же после затравки к каждому обработанному или контрольному самцу подсаживается по 3 виргинных самки. Подсадки самок проводятся еженедельно, с тем, чтобы вести анализ доминантной летальности соответственно стадиям сперматогенеза обработанных самцов. Эмбриональная смертность плодов у самок, забеременевших в первую неделю после введения химического вещества, будет свидетельвотвовать о мутационных событиях, произошедших в зрелых сперматозоидах, 2 неделя соответствует поздним сперматидам, 3 неделя - ранним и средним сперматидам.
Отсаженных от самцов самок вскрывают на 15-17 день беременности. Большая часть доминантных леталей вызывает смерть эмбрионов при или вскоре после имплантации. Погибшие на этой стадии мертвые эмбрионы выглядят как темные гомогенные округлые тела диаметром 2,5-3 мм. При вскрытии регистрируют количество живых и мертвых эмбрионов у каждой самки отдельно. Рекомендуется вскрывать ножницами оба рога матки, особенное внимание обращая на дисталь-ные отделы, так как именно там часто располагаются мертвые эмбрионы, которые в силу своих небольших размеров могут быть неучтены при обычном просмотре матки, растягиваемой двумя пинцетами. Данные вскрытия фиксируют по следующей форме (таблица 5).
Таблица 5.Форма регистрации первичного экспериментального материалов в тесте на доминантные летальные мутации
Номер самца
| Номер самки
| Число живых эмбрионов
| Число мертвых эмбрионов
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
З.6.З.З. Контроли
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать фотрин, циклофосфамид или любой другой известный агент, заведомо обладающий мутагенной активностью на зародышевых клетках млекопитающих.
Негативным контролем является используемый растворитель.
3.6.4. Оценка результатов
В итоговую таблицу 6 вносят данные по каждой серии эксперимента (за серию принимают группу самцов, обработанных определенной дозой изучаемого фармакологического "средства на данной стадии сперматогенеза), включая число беременных самок и процент фертильности.
Таблица 6.Изучение способности фармакологического средства индуцировать доминантные летальные мутации в зародышевых клетках мышей
Стадия сперматогенеза
| Доза
мг/кг
| Число беременных самок
| Фертильность (%)
| Постимплан тационная смертность
| Значение х2-статистик
| Зрелые сперматозоиды
|
|
|
|
|
| Поздние сперматозоиды
|
|
|
|
|
| Ранние сперматозоиды
|
|
|
|
|
|
| 
