Гель-электрофорез ДНК
Электрофорез в агарозном геле
Материалы
1. 10 х буфер трис-борат-ЭДТА (ТБЭ):
0,9 М основный трис,
0,9 М борная кислота,
20 мМ ЭДТА.
рН доводят до 8,1—8,2 сухой борной кислотой
2. Агароза (для электрофореза)
3. Бромистый этидий EtBr: 10 мг/мл в стерильной дистиллированной воде
4. 6х буфер для нанесения: 0,25% бромфеноловый синий, 40% (в/о) сахароза в 1х ТБЭ
10xTBE-буфер ПРОПИСЬ:
10x, pH ~8.3;(храниться при NT в чистой посуде)
Состав
| 1x
| 10x
| Молярность
| 1L
| 500ml
| 100ml
| Tris base
| 89mM
| 0.89M
| 121.14g/M
| 107.8g
| 53.91g
| 10.78g
| Boric acid
| 89mM
| 0.89M
| 61.83g/M
| 55.03g
| 27.51g
| 5.503g
| EDTA, pH 8.0
| 2mM
| 20mM
| 500mM
| 40ml
43.84g
| 20ml
21.92g
| 4.0ml
4.38g
| H2O
|
|
| mQ
| 863.3ml
| 431.65ml
| 86.33ml
|
10x сток вполне устойчиво хранится при NT, если его профильтровать через 0.4µm фильтр.
Для PAAG используется как 1х, для агарозных - как 0.5х. Для агарозных гелей имеет смысл применять при работе с маленькими (< 200bp) фрагментами. Считается, что клонирование из ТВЕ гелей сложнее, чем из ТАЕ.
50xTAE-буфер ПРОПИСЬ
Трис-ацетатный буфер, 1x pH = 7.6:
Tris-acetate 40mM
EDTA 1mM
хранить основной сток при 4oC, рабочее количество (~100ml) при NT
|
|
| 100ml
| 150ml
| 200ml
| 250ml
| 1000ml
| Tris-base
| 2M
| 121.1g/M
| 24.22g
| 36.33g
| 48.44g
| 60.55g
| 242.2g
| EDTA
| 0.05M
| 372.3g/M
| 1.862g
| 2.792g
| 3.723g
| 4.654g
| 18.615g
| Укс. к-та
| ~1.56M
| 17.4M
| ~8.96ml
~9.40g
| ~13.44ml
~14.10g
| ~17.92ml
~18.80g
| ~22.40ml
~23.50g
| ~89.61ml
~94g
| H2O
|
| mQ
| ~73.30g
| ~109.95g
| ~146.60g
| ~183.25g
| ~733g
|
p(50x)=1.0878 удобно вначале растворить Tris и EDTA и лишь затем добавлять кислоту, следя за pH.
Методика
1. Готовят 1 х ТБЭ в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля.
2.Добавляют к 1 х ТБЭ агарозу в количестве, необходимом для получения 0,35—0,45% (в/о) раствора, и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.
3. Охлаждают смесь до +/- 50 °С.
За время охлаждения агарозы, заклеивают края УФ - проницаемой кюветы для геля автоклавированной липкой лентой.
4.Добавляют к раствору агарозы бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают, избегая появления в геле пузырьков воздуха.
5. Теплую агарозу выливают в кювету для геля и равномерно распределяют ее по кювете. Вертикально вставляют гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.
6. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин, затем осторожно удаляют гребенку и липкую ленту. Кювету с гелем помещают в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 х ТБЭ с бромистым этидием в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
7. Подготавливают к электрофорезу образцы исследуемой и маркерной ДНК, для чего смешивают их с буфером для нанесения (5:1, о/о). Чтобы получить четкий сигнал при окрашивании бромистым этидием-EtBr, в лунку шириной 5 мм достаточно внести 200 нг маркерной ДНК. Для построения стандартной кривой необходимо использовать маркерные фрагменты, длина которых примерно равна длине исследуемой ДНК.
(EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.)
8. Осторожно вносят в лунки исследуемую и маркерную ДНК. для повышения точности определения размера маркерную ДНК наносят по обе стороны от исследуемой.
9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—3 В на 1 см геля в течение 1—3 ч.
10. Просматривают гель в УФ-свете на транс иллюминаторе и фотографируют .
| 
