МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ИЗУЧЕНИЮ НЕЙРОЛЕПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Cоставители: д. м. н., проф. Р.У. Островская; чл.-корр. РАМН, проф. К.С. Раевский;
д. м. н., проф. Т.А. Воронина; д. б. н., проф. Т.Л. Гарибова; д. м. н., проф. Г.И. Ковалев;
к. м. н. В.С. Кудрин; к. м. н. В.Б. Наркевич; к. м. н. П.М. Клодт
Введение
Шизофрения (Schizophrenia — от греч. schizo — раскалывать, phren — ум, разум) — тяжелое психическое заболевание, распространенность которого, согласно различным статистическим данным, составляет от 0,1% до 1%. Шизофрения возникает преимущественно в молодом возрасте (15–25 лет) и протекает с быстро или медленно развивающимися изменениями личности особого типа. Прогрессирование заболевания ведет не только к ухудшению качества жизни, но и значительной дезадаптации больных в обществе. Проблема лечения шизофрении является одной из важнейших задач современной психиатрии.
Основными ЛС, применяемыми на протяжении последних 50 лет в терапии психотических состояний, являются нейролептики (антипсихотики). Наряду с их применением при лечении острых проявлений эндогенных заболеваний, они широко используются при различных неврозоподобных расстройствах, включающих обсессивно-фобические, сенесто-ипохондрические, деперсонализационно-дереализационные, сверхценные нарушения, развивающиеся в рамках малопрогредиентного шизофренического процесса, который протекает с постепенным углублением проявлений эмоциональной дефицитарности, когнитивных нарушений, формированием психопатоподобных и/или астенических изменений личности.
Известно, что используемые в клинической практике для лечения шизофрении классические нейролептики эффективны преимущественно в отношении продуктивных симптомов шизофрении, а их систематическое применение приводит к развитию неврологических нарушений экстрапирамидного типа и усугублению дефицитарной симптоматики заболевания. Возможности коррекции дефицитарной симптоматики связывались с атипичными нейролептиками последней генерации, обладающими, наряду
с антидофаминовым действием, также серотонино-негативным эффектом. К ним относятся вещества разного химического строения: дибензазепины (клозапин и его аналоги), бензамиды (сульпирид), производные гамма-карболина (карбидин) и некоторые другие. Основным отличием препаратов этой группы является отсутствие или малая выраженность экстрапирамидных расстройств. Особенность механизма действия атипичных нейролептиков определяется избирательным угнетением мезолимбической и мезокортикальной дофаминергических систем мозга при меньшей степени воздействия на нигростриатную систему. Однако эти препараты проявляют побочные эффекты, связанные с явлениями гиперпролактинемии: ожирение, сахарный диабет, гипертоническая болезнь, половые дисфункции. К тому же до 25–30% больных полностью резистентны к действию всех известных нейролептиков. Эти обстоятельства, так же как и разнообразие индивидуальных проявлений шизофрении у различных людей, диктуют необходимость поиска принципиально новых стратегий создания высокоэффективных антипсихотиков, лишенных побочных эффектов.
Стратегия поиска антипсихотических веществ строится на ряде основных положений, к которым относятся следующие:
а) дофаминергическая гипотеза шизофрении предполагает, что в основе антипсихотического эффекта нейролептиков лежит их способность оказывать центральное дофаминергическое действие;
б) функциональная неоднородность дофаминергических систем мозга (связь нигростриатной системы с контролем моторных функций, с одной стороны, участие мезолимбической и мезокортикальной систем в опосредовании высших интегративных функций мозга и эмоциональной сферы — с другой);
в) молекулярная, функциональная и фармакологическая гетерогенность рецепторов основных нейромедиаторных систем мозга, вовлеченных в механизмы действия психотропных веществ (дофаминовые, серотониновые, гистаминовые, ГАМК, глутаматные и другие рецепторы);
г) моделирование структуры активного центра рецептора и компьютерный дизайн соединений, обладающих высоким сродством к последнему.
Методология поиска веществ с атипичным профилем нейролептической активности строится на применении экспериментальных методов скрининга in vitro и in vivo.
Это в первую очередь широкий круг поведенческих методик, методика радиолигандного связывания, биохимические методы оценки состояния нейромедиаторных систем мозга, некоторые специальные методы исследования, в частности нейроэндокринологические.
Некоторые из этих методов достаточно трудоемки, требуют специального оборудования, в связи с чем могут рассматриваться в качестве дополнительных. Идеология и экспериментальные подходы, изложенные выше, легли в основу настоящих методических рекомендаций.
Методы изучения специфической активности нейролептиков
Все методы следует разделить на три группы:
поведенческие методы;
методы определения нейрорецепторного профиля соединения (в том числе методы радиолигандного связывания);
биохимические и другие дополнительные методы.
1. Поведенческие методы изучения специфической активности нейролептиков
1.1. Влияние на феномен «вертикализации», вызванной введением апоморфина у мышей
Исследования проводятся на мышах согласно методике [15]. Животных помещают в цилиндрические стандартные камеры с плексигласовым дном, высотой 14 и диаметром 12 см, изготовленные из проволочного прутка толщиной 2 мм при расстоянии между прутьями 1 см. Апоморфин (2–5 мг/кг) вводят подкожно непосредственно перед помещением животных в камеры. Регистрация стереотипного поведения проводится многократно каждые 2 мин. на протяжении 1 ч. Фиксируются следующие поведенческие показатели: количество лап животного на сетке (феномен «вертикализации»), обнюхивание, грызение, лизание, кусание при каждом наблюдении. Одновременно в исследовании наблюдается до 30 животных. По окончании исследований подсчитывается суммарный балл стереотипии для каждого животного за весь период наблюдений. При оценке число баллов соответствует числу лапок на сетке. Для других форм стереотипного поведения используются следующие критерии: обнюхивание — 1 балл (слабая стереотипия), грызение, лизание и кусание — 2 балла (выраженная стереотипия). Для каждой экспериментальной группы подсчитывается величина Mim с использованием критерия Манна-Уитни. Данный тест имеет большее прогностическое значение для выявления собственно психотропного действия, чем тест апоморфиновой стереотипии у крыс, поскольку как типичные нейролептики, так и соединения с атипическим профилем обладают способностью угнетать феномен «вертикализации». Тест позволяет выявить способность веществ блокировать дофаминергическую передачу в мезолимбической системе мозга. В то же время следует отметить, что подобный эффект характерен также и для некоторых веществ, не обладающих антипсихотическими свойствами — пропранолола, диазепама, амитриптилина,
миансерина, ареколина, физостигмина и др.
В качестве модификации описанного теста предлагается использование амфетамина (2,5 мг/кг, внутрибрюшинно) вместо апоморфина.
1.2. Влияние на стереотипное поведение, вызванное введением апоморфина у крыс
Данный тест является одним из наиболее информативных и широко ис пользуется для выявления способности веществ блокировать дофаминергическую нейропередачу в нигростриатной системе мозга. Подобное действие характерно для соединений с типичным профилем нейролептической активности. В качестве экспериментальных животных используются крысы. Животным подкожно вводится агонист дофаминовых рецепторов апоморфин в дозах 0,3–1 мг/кг. Оценивается интенсивность стереотипных реакций: принюхивания, грызения, лизания. Принята трехбалльная шкала оценки поведенческих феноменов, согласно которой отдельным стереотипным движениям (в том числе непостоянному принюхиванию) приписывается оценка в 1 балл, в то время как наличие непродолжительно длящейся интенсивной стереотипии (в том числе лизания и грызения) оценивается в 2 балла.
Постоянная интенсивная стереотипия оценивается в 3 балла. Оценку проводят повторно в течение 1 мин через 15–30 мин после введения апоморфина, наблюдение ведется в течение 1–2 ч. Учитывается интенсивность и общая продолжительность стереотипного поведения.
Данный тест специфичен для нейролептиков, являющихся производными фенотиазина и бутирофенона. В то же время некоторые атипичные нейролептики, такие как сульпирид и клозапин, не оказывают заметного влияния на апоморфиновую стереотипию, карбидин может ее усиливать. В связи с этим результаты данного теста не могут считаться решающими для заключения о наличии антипсихотического эффекта.
Угнетение стереотипии указывает на способность исследуемого вещества оказывать угнетающее влияние на дофаминергическую нейропередачу в нигростриатной системе мозга.
1.3. Влияние на эффекты малых (пресинаптичских) доз апоморфина
Апоморфин в малых дозах (0,01–0,15 мг/кг) вызывает зевательные движения у крыс, что предположительно связано с влиянием на пресинаптические дофаминовые рецепторы. Для проведения теста группе из 8–10 животных вводится апоморфин в дозе 0,1 мг/кг, после чего подсчитывается число зеваний каждого животного в течение часа. Известно, что нейролептики обладают способностью угнетать этот эффект апоморфина даже в малых дозах. Данный тест является наиболее чувствительным из существующих в настоящее время методик, позволяющих выявить способность нового соединения блокировать пресинаптические рецепторы дофамина.
1.4. Влияние на рвоту, вызванную апоморфином
Исследования проводят на собаках. Апоморфин вводят в дозе 0,1 мг/кг в вену и регистрируют появление рвоты. Все известные нейролептики угнетают рвоту, вызванную апоморфином, блокируя дофаминовые рецепторы рвотного центра продолговатого мозга.
1.5. Влияние на амфетаминовую гиперактивность у мышей
Амфетамин (фенамин) вызывает увеличение спонтанной двигательной активности у мышей, что связывают с усилением дофаминергической нейропередачи предположительно в мезолимбической системе головного мозга. Животным спустя 15–30 мин после исследуемого вещества подкожно вводят амфетамин в дозе 2,5–10 мг/кг и регистрируют двигательную активность в актометре в течение 1–2 ч. Типичные нейролептики проявляют дозозависимый антагонизм по отношению к эффекту амфетамина, в то время как атипичные действуют, как правило, значительно слабее или не угнетают амфетаминовую
гиперактивность. Вещества с антидепрессантной активностью могут усиливать эффект амфетамина.
1.6. Влияние на амфетаминовую стереотипию у крыс
Исследования проводят на крысах. Животным подкожно вводят амфетамин (фенамин) в дозе 2,5–5 мг/кг и через 15–30 мин регистрируют интенсивность стереотипных движений, используя шкалу, аналогичную описанной в разделе 1.2. Типичные нейролептики угнетают амфетаминовую стереотипию в отличие от атипичных, не проявляющих подобной активности в этом тесте. Более того, некоторые атипичные нейролептики (сульпирид, клозапин, карбидин) могут потенцировать стереотипию, что, очевидно, указывает на возможный антидепрессивный компонент в спектре их фармакологического действия.
1.7. Влияние на угнетение «стартл-реакции»и ее препульсовое ингибирование
Хотя указанные тесты четко позволяют выявить нейролептическую активность исследуемого вещества, более важную информацию о его клинических перспективах может дать «трансляционная» модель шизофрении [13], в качестве которой используется нарушение предстимульного торможения (ПСТ) в акустическом стартл-рефлексе (ACР). Этот феномен, который может быть воспроизведен как на человеке, так и на животных, заключается в уменьшении реакции вздрагивания на внезапный сверхпо-
роговый звуковой раздражитель предшествующим слабым подпороговым стимулом.
ПСТ является проявлением торможения сенсомоторных реакций (sensorimotor gating), дефицит которого лежит в основе нарушения селективного внимания у шизофреников [7]. Терапия нейролептиками устраняет дефицит ПСТ. Дефицит ПСТ, характерный для больных шизофренией, в эксперименте моделируется введением дофамино-позитивных либо глутамат-негативных веществ.
Исследования проводятся на крысах-самцах массой 250–300 г. За 24 ч до процедуры угашения АСР животное адаптируют к экспериментальной камере в отсутствие звуковых сигналов. При проведении сеанса угашения крыс помещают в экспериментальную камеру и в течение 5 мин регистрируют реакцию замирания, затем предъявляют 10 сильных звуковых раздражителей длительностью 500 мс с интервалом между стимулами 20 с. Спустя 24 ч после обучения животных вновь помещают в экспериментальную ка-
меру, в течение 5 мин регистрируют поведение замирания с последующим тестированием долговременного привыкания АСР (10 звуковых стимулов через 20 с). Регистрация АСР осуществляется с помощью специальной камеры, соединенной через электронную систему тензоусилителя с самописцем и компьютером. Амплитуда АСР измеряется в течение 100 мс после подачи звукового раздражителя. Подача сильных звуковых сигналов осуществляется через усилительную головку. В качестве стимула используют широкополосный шум длительностью 500 мс и громкостью 110 дБ, а в качестве фонового,
маскирующего звукового сигнала применяют широкополосный шум громкостью 72 дБ. Регистрацию реакции замирания — времени полного отсутствия движения животного, включая движение вибрисс, осуществляют визуально. Если непосредственно перед акустической стимуляцией животному предъявляется дополнительный звуковой сигнал, наблюдается так называемое препульсовое ингибирование, т.е. уменьшение реакции на звуковой сигнал. Поскольку нейролептики избирательно подавляют феномен препульсового ингибирования, метод является достаточно специфичным.
1.8. Тест экстраполяционного избавления
Исследования проводят на крысах масссой 220–280 г, по методике [1] в экспериментальной установке, которая представляет собой цилиндрическую емкость с водой (диаметр 35 см, высота 40 см), наполненную водой с температурой 22°С на глубину 17,5 см от дна. В центре сосуда укреплен прозрачный стеклянный цилиндр диаметром 9 см, высотой 22 см, нижний край которого погружен в воду на глубину 2,5 см. Крыс помещают внутрь цилиндра хвостом вниз и наблюдают за поведением на протяжении 2 мин. Регистрируется латентный период двигательной активности, число безуспешных попыток избегания, реализуемых в форме прыжков, и латентный период подныривания. После совершения подныривания (или, в случае отсутствия подныривания, — по истечению срока тестирования).
1.9. Влияние на ориентировочно-двигательную реакцию и локомоторную активность
Исследования проводятся на мышах или крысах. Для определения ориентировочной реакции животное помещают в открытое поле, пол которого разделен на секторы.
Подсчитывают число вставаний на задние лапы (вертикальная составляющая ориентировочной реакции), число пересеченных квадратов (горизонтальная компонента), а также число заглядываний в отверстия в полу (норковое поведение, отражающее исследовательскую активность) за 2,5–5 мин наблюдения.
Для регистрации двигательной активности используются различные типы актометров. В настоящее время наиболее распространенным является фотоэлектрический актометр типа «Варимекс». Источники света находятся напротив фотоэлементов, расположенных на различных уровнях внутри камеры. Пересечение животным луча света регистрируется счетчиком, данные могут выводиться на компьютер. Для определения двигательной активности животных предварительно адаптируют к экспериментальной камере в течение 30 мин для исключения ориентировочной компоненты двигательной активности. В зависимости от задачи исследования наблюдение осуществляется в течение 0,5–4 ч. Данные тесты позволяют выявить общее депримирующее действие. В то же время они не являются специфическими, поскольку многие вещества других фармакологических групп (снотворные, седативные, транквилизаторы) также способны угнетать ориентировочно-двигательную реакцию и локомоторную активность животных.
1.10. Изучение каталептогенных свойств веществ
Каталепсия, т.е. способность животного удерживать искусственно приданную ему позу, является одним из проявлений побочных нежелательных экстрапирамидных эффектов препаратов с нейролептической активностью. Для оценки каталептогенного действия вещества используют несколько разновидностей методов, позволяющих оценить способность животного (крысы, мыши) сохранять искусственно приданную позу [16]. Наиболее часто применяют тест «поза лектора». Передние лапы животного
помещают на горизонтальную проволочную перекладину, расположенную на высоте 4 см (мыши) или 10 см (крысы), регистрируют время сохранения позы и определяют количество животных в группе удержавших «позу лектора» в течение 60 с [5]. В другом варианте, по Morpurgo [10], регистрируется удержание лап на ступеньках высотой 3 см и 10 см (тест «лестница») и удержание животного на параллельных стенках. В тесте «лестница» оценивается способность крысы в течение 10 сек не возвращать в исходное положение лапу, поднятую на ступеньку. Глубина каталепсии оценивается по 6-балльной системе: 1 — только одна из передних лап остается на нижней ступеньке; 2 — последовательно обе лапы остаются на нижней ступеньке; 3 — только одна из передних лап остается на верхней ступеньке; 4 — последовательно обе лапы остаются на верхней ступеньке.
В тесте двух параллельных стенок крысу помещают между этих стенок высотой 11 см таким образом, чтобы передними конечностями она опиралась на одну стенку, а задними — на другую, так чтобы спина животного оставалась прямой. Фиксируется длительность удержания животного в этой неестественной позе. Максимальное время наблюдения составляет 120 с. При альтернативной оценке критерием наличия каталепсии считают пребывание в неподвижном состоянии на перекладинах (стенках) в течение 45 с. Попытки придать животному нужную позу продолжаются не более 1 мин. Каталепсию можно оценивать и количественно с использованием различных шкал интенсивности. При этом в качестве критерия каталептогенного действия используют способность животных сохранять заданную позу в течение 60–120 с наблюдения. Тестирование проводят обычно каждые 30 мин в течение 3–4 ч, что позволяет получить информацию о динамике развития и продолжительности действия исследуемого вещества. Широко распространена шкала Di Chiara-Morelli, где 1 балл соответствует 15–29 с удержания позы, 2 балла — 30–59 с и 3 балла — 60 с и более. Следует, однако, учитывать, что при повторном тестировании интенсивность каталепсии может увеличиваться не только за счет фармакологического эффекта вещества, но и вследствие выработки обстановочного условного рефлекса.
1.11. Изучение дискинетического потенциала нейролептиков
Длительное применение нейролептиков может вызывать у больных неврологические нарушения в виде дискинезии. Наиболее опасное осложнение длительного приема нейролептиков — поздняя дискинезия. Предполагается, что одной из причин развития дискинезии является компенсаторное увеличение числа дофаминовых рецепторов в ЦНС в ответ на длительную блокаду дофаминергической передачи, вызванную нейролептиками. Имеется корреляционная связь между дискинетическим потенциалом нейролептиков и их способностью вызывать гиперчувствительность дофаминовых рецепторов стриатума при повторном введении. Способность нейролептиков вызывать компенсаторное повышение активности дофаминергической системы удается выявить в эксперименте на животных при повторном введении веществ с их последующей отменой.
Исследования проводят на крысах. Исследуемые вещества вводят ежедневно в течение 3–4 нед. Параллельно контрольным группам животных вводится изотонический раствор NaCl и галоперидол 0,3–1 мг/кг внутрибрюшинно в качестве эталонного препарата. Затем вещества отменяют и на 4–5-й день после отмены контрольным и получавшим ЛС животным вводят апоморфин 0,5 мг/кг. Каждые 15 мин в течение часа оценивают интенсивность апоморфиновой стереотипии. Если у животных, получавших
изучаемое соединение, наблюдается усиление апоморфиновой стереотипии по сравнению с контрольной группой, то это свидетельствует о развитии гиперчувствительности дофаминовых рецепторов, а следовательно, о возможности появления дискинезии в условиях хронического применения. Биохимические доказательства гиперчувствительности могут быть получены с использованием методов радиолигандного связывания и определением величины Вмax, отражающей число функционирующих дофаминовых рецепторов.
1.12. Влияние на ректальную температуру
В исследованиях используются мыши или крысы. Температуру измеряют при помощи электротермометра с ректальным датчиком. У мышей ректальная температура определяется при погружении электрода на глубину 1,5–1,8 см, у крыс — на глубину 2,5 см.
Для большинства нейролептиков характерно гипотермическое действие.
1.13. Оценка влияния на гипногенный эффект барбитуратов
Известно, что потенцирование наркотического действия барбитуратов является свойственным для многих известных нейролептиков. Исследования проводят на мышах массой 20–22 г. Предполагаемый нейролептик вводят внутрибрюшинно за 10 мин до гексенала (30 мг/кг, внутрибрюшинно). Указанная доза гексенала является подпороговой, т.е. при ее использовании засыпает лишь часть животных. Определяют процент уснувших животных, время наступления сна и длительность сохранения бокового положения (в минутах). Увеличение процента уснувших животных свидетельствует о повышении порога чувствительности к действию барбитуратов. Отсутствие у нейролептика влияния на длительность гексеналового сна позволяет предположить, что он не оказывает угнетающего влияния на микросомальные системы печени, метаболизирующие барбитураты. Это позволяет охарактеризовать препарат как «истинный потенциатор» по классификации [4].
1.14. Влияние на 5-окситриптофановый гиперкинез у мышей
Предшественник серотонина — 5-окситриптофан — вызывает у мышей характерный гиперкинез в виде резких встряхиваний головой (twitches) продолжительностью 30–60 мин, что объясняется активацией серотонинергической системы ЦНС. Группе из 8–10 мышей вводится внутрибрюшинно 5-окситриптофан в дозе 300 мг/кг через 30 мин после введения исследуемого вещества. Подсчитывается число встряхиваний головой за 1 мин для каждого животного с интервалами 10 мин в течение 60 мин. Многие нейролептики угнетают встряхивания, что указывает на наличие у них центрального серотонино-блокирующего действия. В ряде работ высказывается предположение о том, что антигаллюцинаторный эффект нейролептиков может быть связан с блокадой серотониновых рецепторов в ЦНС.
1.15. Влияние на ареколиновый тремор
Данный тест используется для выявления центрального М-холиноблокирующего действия веществ. Исследования проводят на мышах. Изучаемое вещество вводится однократно за 30 мин до подкожного введения ареколина в дозе 25 мг/кг. Регистрируется длительность тремора. О наличии антихолинергического действия говорит уменьшение продолжительности тремора или его полное устранение.
1.16. Влияние на условные рефлексы
Исследования проводятся на мышах или крысах. Используются методики, позволяющие быстро выработать условный рефлекс у животных. Наиболее часто применяются методы условного рефлекса активного или пассивного избегания, позволяющие изучить влияние соединений на скорость выработки и угасания условной реакции оборонительного типа.
1.16.1. Условный рефлекс активного избегания (УРАИ)
Известно, что оборонительные условные рефлексы проявляют высокую чувствительность к угнетающему действию нейролептиков. В связи с этим данная методика может быть рекомендована для включения в число обязательных тестов расширенного этапа изучения новых нейротропных соединений с потенциальной нейролептической активностью.
Сущность метода заключается в том, что крыса, стремясь избежать болевого раздражения через электродный пол, взбирается на вертикальный стержень и удерживается на нем в течение всего периода безусловного раздражения. Условным сигналом является звук (или свет); через 5 с к нему присоединяется электрическое раздражение, длящееся также 5 с. Как правило, крыса быстро усваивает безусловную реакцию бегства, а затем у нее возникает условно-оборонительный рефлекс, получивший название условного рефлекса избегания.
Для исследования веществ отбираются лишь крысы с прочным коротколатентным условным рефлексом (процент положительных реакций на условный сигнал без подкре пления в контрольных исследованиях должен быть не ниже 85–90%). Вещества вводятся внутрибрюшинно или per os в дозах, оказывающихся эффективными по тесту фенаминовой локомоторной гиперактивности или апоморфиновой вертикализации у мышей.
В исследованиях по изучению влияния на угашение УРАИ применяется только условный сигнал без болевого подкрепления. Реакция учитывается по степени увеличения латентного периода условной реакции, а также в альтернативной форме, т. е. по числу животных в группе, у которых подавление условного рефлекса было полным.
Все известные нейролептики замедляют выработку условного рефлекса и ускоряют его угасание. В отличие от психотропных веществ других фармакологических групп нейролептики влияют на угашение условного рефлекса в дозах, не вызывающих подавления двигательной активности. Результаты исследований с условно-оборонительным рефлексом избегания обнаруживают удовлетворительную корреляцию с активностью нейролептиков в клинике при лечении психически больных.
1.16.2. Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ)
Обучение основано на врожденном стремлении крыс к пребыванию в небольшом затемненном пространстве. Преимущество метода состоит в том, что в зависимости от изменения схемы введения веществ можно оценить их влияние на различные этапы формирования памятного следа — образование, фиксацию и воспроизведение приобретенного навыка избегания.
Выработку и воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) осуществляется в 2-секционной установке, состоящей из платформы размером 24,5×6 см, подвешенной над полом на высоте 1 м и освещенной лампой мощностью 60 Вт, и камеры размером 39×39×39 см с электродным полом и черными стенками. Электродный пол набран из металлических прутьев диаметром 3 мм, расстояние между прутьями — 11 мм.
Отделение с электродным полом отгорожено от платформы гильотинной дверью, закрывающей отверстие 6×6 см.
Крысу помещают на ярко освещенную платформу хвостом к отверстию в камеру с электродным полом. Фиксируют латентный период первого захода в отделение с электродным полом (переходом считается перемещение животным всех 4 лап в другое отделении установки). По истечении 3 мин, в тот момент, когда животное находится в камере с электродным полом, отверстие в перегородке закрывается и через пол наносится неустранимое электроболевое раздражение в виде 5 ударов током силой 0,45 мА и дли-
тельностью 1 с каждый. После этого крыса извлекается из установки.
Сохранность УРПИ оценивают через 24 ч после обучения. Для этого крысу снова помещают на висячую платформу и регистрируют время захода в камеру и время пребывания в камере. Воспроизведение УРПИ через 24 ч позволяет оценить долгосрочные мнестические процессы.
2. Определение нейрорецепторного профиля нового соединения
2.1. Общая стратегия исследования
Исследованиями последнего времени установлено, что рецепторы нейротрансмиттеров, прежде всего дофамина и серотониниа, являются гетерогенными и подразделяются на несколько подгрупп. Так, среди дофаминовых рецепторов принято выделять 2 основные подгруппы, обозначаемые как Д1 и Д2, последние, в свою очередь, включают в себя Д1 и Д5 подтипы (подгруппа Д1-подобных рецепторов) и Д2, Д3, Д4 (подгруппа Д2-подобных рецепторов). Принципиальное отличие между рецепторами состоит
в том, что первые активируют синтез циклического АМФ, вторые либо его угнетают, либо не оказывают влияния. Описано также несколько подтипов серотониновых рецепторов, сродство к которым проявляют многие из современных антипсихотических средств. Наиболее важными для понимания механизма нейролептического действия являются рецепторы 5-НТ2 подтипа. Для всех указанных выше подтипов нейрорецепторов созданы вещества — лиганды, проявляющие ту или иную степень избирательно-
го действия, в основе которого лежит специфическое сродство (аффинитет) к данному рецептору. В переднем мозге наиболее широко представлены рецепторы Д1, Д2 и 5-НТ2 подтипов, с которыми взаимодействуют практически все известные в настоящее время нейролептики. В связи с этим определение способности нового соединения с предполагаемой антипсихотической активностью связываться с указанными подтипами рецепторов является обязательным условием его доклинического изучения. Нейролептики последнего поколения, включая клозапин, оланзепин, рисперидон, проявляют высокую степень сродства (аффинитета) к рецепторам Д1, Д2 и 5-НТ2 подтипов [6,14]. В качестве ли-
ганда, способного связываться с обоими подтипами рецепторов, используется меченый спироперидол (спиперон). Высокой избирательностью в отношении 5-НТ2 подтипа рецепторов обладает кетансерин, являющийся, как и спироперидол, антагонистом (блокатором) этих рецепторов и широко используемый в качестве радиолиганда при скрининге соединений с нейролептической активностью. Важное значение для характеристики рецепторного профиля новых нейролептиков имеет определение степени их сродства к альфа-адренорецепторам ЦНС. Из числа наиболее распространенных антипсихотических препаратов аминазин, галоперидол и клозапин обладают способностью связываться с этими рецепторами наряду с высоким аффинитетом к рецепторам Д2 и 5-НТ2 типа.
В последнее время большой интерес привлекают к себе два других подтипа дофаминовых рецепторов — ДЗ и Д4, относящиеся к Д2-подобным. Способностью связываться с этими рецепторами обладают атипичные нейролептики, в частности клозапин. Принято считать, что наибольшую прогностическую значимость в плане предсказания нейролептической активности новых химических соединений имеет их сродство к дофаминовым рецепторам Д2 подтипа, наиболее широко представленным в областях мозга, где локализованы окончания дофаминергических нейронов (стриатум, прилежащее ядро, префронтальная, цингулярная, фронтальная кора, обонятельный бугорок).
Для большинства нейролептиков установлена высокая степень корреляции между характеристиками связывания вещества с Д2 рецептором, с одной стороны, и средней терапевтической дозой, обеспечивающей антипсихотический эффект в клинике, — с другой. Поскольку избирательные лиганды Д1 подтипа дофаминовых рецепторов не прошли антипсихотической активности в клинике, для практических целей скрининга можно считать достаточным определение количественных характеристик сродства (обычно это IС50, т.е. концентрация вещества, при которой имеет место 50% вытеснение 3Н-спироперидола) данного соединения к Д2 дофаминовому рецептору. Перспективными принято считать
соединения, проявляющие сродство к Д2, 5-НТ2 и альфа-адренорецепторам в нанограммовом диапазоне концентраций (IС50, в пределах 108 М) [8, 9]. При наличии активности этого уровня целесообразно провести более широкое изучение рецепторного профиля вещества, включая определение IС50 по связыванию с 5-НТ1, 5-НТЗ серотониновыми рецепторами [12], бета-адренорецепторами, мускариновыми холинорецепторами, Д1, ДЗ, Д4-подтипами дофаминовых рецепторов, гистаминовыми рецепторами, сигма-сайтом NMDA-рецепторного комплекса, ГАМК-рецептором, транспортными белками, обеспечи-
вающими обратный захват дофамина и других нейротрансмиттеров. Эти исследования позволяют получить достаточно полный «нейрорецепторный профиль» соединения.
2.2. Методика радиолигандного связывания
В настоящее время методы радиолигандного связывания, используемые для характеризации способности нового соединения связываться с тем или другим рецептором (подтипом рецептора), являются наиболее важными в скрининге нейролептиков. Метод радиолигандного связывания позволяет непосредственно качественно и количественно оценить взаимодействие вещества с рецепторами, изучить связь между структурой и действием и провести сравнительную оценку соединений по силе взаимодействия с
рецептором. По сравнению с поведенческими методами скрининга и биохимическими методами, методы радиолигандного связывания просты в техническом отношении и не требуют больших количеств животных, реактивов и исследуемых веществ, что особенно важно при работе с большим числом соединений.
В качестве радиолиганда дофаминовых рецепторов используется 3Н-спиперон с удельной активностью 15–40 Ки/ммоль. 3Н-спиперон метит также 5-НТ2 серотониновые рецепторы, поэтому его с успехом можно применять для оценки взаимодействия веществ с 5-НТ2 рецепторами. Рекомендуется изучить влияние веществ на связывание с препаратами мембран, полученными из различных структур мозга (стриатума, лимбической системы и фронтальной коры). В стриатуме и структурах лимбической системы
3Н-спиперон связывается, главным образом, с дофаминовыми (Д2), во фронтальной коре — с серотониновыми (5-НТ2) рецепторами [14].
Изучаемые структуры выделяют из мозга 3–4 крыс, взвешивают и гомогенизируют в ледяном 50 мМ Трис-HCl буфере (рН = 7,5; t = 20 °С) в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (900–1000 об/мин, 7–10 пассажей). Гомогенат центрифугируют 30 000 g 20 мин при 0–4 °С, осадок ресуспендируют в 5 мМ трис-буфере, содержащем 120 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСl, 6 мМ КСl и 1 мМ MgCl (рН = 7,1 при t = 37 °С).
Суспензию мембран (0,1 мг белка/мл) инкубируют с 3Н-спироперидолом (0,1–0,25 нМ) в отсутствие и присутствии различных концентраций исследуемых веществ (0,1–10 мкМ) при 25 °С 30 мин или 37 °С 10–15 мин и связанный спиперон выделяют фильтрованием на стекловолокнистых фильтрах типа GF/B («Whatman»). Радиоактивность, оставшуюся на фильтрах, подсчитывают методом жидкостного сцинтилляционного счета.
Рассчитываются концентрации веществ, угнетающие связывание 3Н-спиперона на 50% (1Сд).
Большинство известных нейролептиков угнетают связывание 3Н-спиперона в наномикромолярном диапазоне концентраций. Поскольку как агонисты, так и антагонисты дофаминовых рецепторов вытесняют 3Н-спиперон из мест связывания, то для их разграничения рассчитывают коэффициент Хилла. Для большинства антагонистов он близок к 1, а для антагонистов — значительно ниже 1. У известных нейролептиков способность вытеснять 3Н-спиперон обнаруживает достаточно высокую степень корреляции с их антипсихотическим действием и выраженностью экстрапирамидных расстройств.
Аналогично проводится исследование связывания 3Н-спиперона с серотониновыми рецепторами фронтальной коры [8]. Если изучаемое вещество в наномолярных концентрациях вытесняет радиолиганд из мест связывания, идентифицированных как серотониновые рецепторы, это указывает на наличие серотониноблокирующего действия. Для определения аффинитета исследуемого соединения к другим рецепторам используются соответствующие радиолиганды.
3. Биохимические методы, используемые для углубленного анализа действия нейролептиков на моноаминергические системы
3.1. Влияние на содержание катехоламинов, серотонина и их метаболитов структурах мозга крыс
Наиболее чувствительным, точным и общепринятым является в настоящее время метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с элек трохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) (10). Для определения содержания моноаминов в структурах мозга рекомендуется использовать ВЭЖХ/ЭД в обращенных фазах с ионпарным реагентом октилсульфатом натрия. Маточные растворы моноаминов и внутреннего стандарта 3,4-диоксибензиламина (ДОБА) с концентрацией 0,5 мкмоль/мл готовятся 2 раза в месяц 0,1 Н НСIO4, с добавлением 1% метабисульфата натрия. Рабочие стандарты (0,5 нмоль/мл),
необходимые для калибровки прибора, готовятся ежедневно.
Вещество с предполагаемой нейролептичекой активностью вводится внутрибрюшинно или перорально за 60 мин до декапитации крыс. Структуры мозга (стриатум, прилежащее ядро перегородки, гипоталамус и др.) выделяют на холоде, замораживают в жидком азоте и взвешивают. При анализе моноаминов навеску ткани гомогенизируют в 20 объемах 0,1 н НСIO4, с добавлением ДОБА (0,5 нмоль/мл). Затем образцы центрифугируют при 15 000 g в течение 5 мин. Для определения катехоламинов, серотонина (5-ОТ),
5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты (ГВК) 20 мкл чистого надосадка наносят на колонку путем прямой инъекции. Разделение изучаемых веществ проводят на хроматографе типа LC-304 Т (ВАS), снабженном инжектором 7125 Reodyne 20 мкл петлей для нанесения образцов. Используют колонку Biophase RP-18 октадецилсилановую 4,6 250 мм, защищенную предколонкой RP-18 4,6 мм 30 мм, 20 мкм колонку термостатируют при 45°С. В качестве детектора используют амперометрический детектор LC-4B со стеклоуглеродным электродом TL-5. Потенциал, приложенный к рабочим электродам, составляет +850 мВ против Ag/AgCl электрода сравнения RE-3. Скорость потока — 1 мл/мин.
Для определения катехоламинов, серотонина, 5-ОИУК, ДОФУК и ГВК используют следующую подвижную фазу. Маточные растворы 0,02 М лимонной кислоты и 0,02 М NaH2PO4, буфера, содержащего 0,269 мМ ЭДТА, смешиваются в пропорции 2,45:1. Затем добавляется 0,3 мМ ОСН и 10% ацетонитрила, рН = 3,0 устанавливается добавлением фосфорной кислоты. Подвижную фазу фильтруют, применяя вакуумный насос, через целлюлозные фильтры (0,2 мкм) типа «Миллипор» или «Владипор». Известные нейролептики вызывают повышение содержания метаболитов ГВК и ДОФУК, что свидетельствует об увеличении скорости метаболического оборота дофамина. Последнее может рассматриваться как компенсаторная реакция, развивающаяся в ответ на блокаду дофаминовых рецепторов нейролептиками.
По этому тесту типичные нейролептики более активны, чем атипичные. Определение содержания аминов и их метаболитов в различных структурах мозга позволяет выявить структурную избирательность действия веществ. Используют, как правило, стриатум, прилежащее ядро перегородки, фронтальную кору мозга.
Для более детальной характеризации взаимодействия новых соединений с нейро-трансмиттерными системами мозга рекомендуется использовать методику определения скорости метаболического оборота моноаминов с применением ингибитора декарбоксилазы L-ароматических аминокислот (соединение NSD-1015), а также технику внутримозгового микродиализа, позволяющую оценить влияние вещества на пресинаптическую регуляцию биосинтеза и высвобождения нейротрансмиттера (дофамина, серотонина). Последние методы могут рассматриваться как дополнительные.
3.2. Метод внутримозгового микродиализа у свободноподвижных животных
Методика внутримозгового микродиализа у свободноподвижных животных может использоваться для определения внеклеточного содержания моноаминов мозга в дорзальном и вентральном стриатуме (прилежащее ядро) в условиях in vivo. Известно, что соединения с нейролептической активностью повышают внеклеточное содержание метаболитов ДА — ДОФУК и ГВК. В исследовании используются концентрические микродиализатные зонды CMA12 (CMA/Microdialysis AB, Швеция). Крыс наркотизируют хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б) и фиксируют в стереотаксисе. Затем, в прилежащее ядро имплантируют направляющие канюли для микродиализных зондов CMA12 с проницаемостью 20000 ДА (CMA Microdialisys) по координатам AP + 1,7 мм; L – 2,6 мм; DV – 8,2 мм [11], под углом 10 градусов к сагиттальной пло-
скости и фиксируют их к костям черепа. Через 48 ч после операции зонды помещают в направляющую канюлю и в течение двух часов производят перфузию искусственной цереброспинальной жидкостью со скоростью 2 мкл/мин [3]. Сбор диализатов происходиткаждые 20 мин. В течение первых 60 мин собирают 3 базальных образца, затем животным внутрибрюшинно вводят изучаемое соединение. После этого собирают еще 5–8 диализных проб. Содержание моноаминов и их метаболитов в диализатах определяют методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией [10].
3.3. Модель прерывания импульсной активности нейронов
(гаммабутиролактоновая модель)
Одним из наиболее информативных подходов к характеризации фармакологических свойств соединений с нейролептической активностью может быть изучение способности веществ устранять эффект агонистов ДА рецепторов, подавляющих синтез дофамина, на модели прерывания импульсной активности нейронов (гамма-бутиролактоновая модель).
Введение гамма-бутиролактона (ГБЛ) в дозе 750 мг/кг, в/б, позволяет блокировать импульсную активность ДА нейронов [2]. При этом нарушается регуляция синтеза дофамина, которая осуществляется ДА нейронами черной субстанции и постсинаптическими рецепторами в стриатуме. В условиях пониженного уровня ДА в межсинаптической щели происходит снижение ингибирующего влияния Д2 ауторецепторов на тирозингидроксилазу (ТГ) — фермента, лимитирующего скорость синтеза ДА. Нейролептики, конкурируя с агонистами ДА рецепторов за места связывания пресинаптических рецепторов ДА, повышают активность ТГ и, следовательно, скорость синтеза ДА. Применение ингибитора
декарбоксилазы ароматических аминокислот — NSD-1015 в гаммабутиролактоновой модели позволяет оценить влияние исследуемого вещества на способность ТГ синтезировать предшественник ДА — диоксифенилалланин (ДОФА), который в нормальных условиях практически не определяется. Для определения содержания ДОФА и моноаминов в структурах мозга рекомендуется использовать ВЭЖХ/ЭД, описанный выше (раздел 3.1).
3.4. Изучение влияния на уровень секреции пролактина
Секреция пролактина регулируется дофаминергическими волокнами тубероинфундибулярного тракта, берущего начало в области аркуатного и перивентрикулярного ядер гипоталамуса. Дофаминовые рецепторы пре имущественно Д2 подтипа локализованы на секреторных клетках переднего гипофиза, где они выполняют функцию ингибиторного контроля секреции пролактина. Нейролептики при введении людям или экспериментальным животным, блокируя Д2 дофаминовые рецепторы, вызывают усиление секреции пролактина, что может быть причиной таких нежелательных побочных эффектов, как галакторея, аменорея, бесплодие, гиперплазия молочной железы.
Нейролептики нового поколения, благодаря своему низкому сродству к Д2 рецепторам тубероинфундибулярной системы, как правило, не вызывают пролактинемию.
Для оценки возможного влияния нового соединения с предполагаемой нейролептической активностью на дофаминергическую передачу в туберо инфундибулярной системе крысам вводят вещество в терапевтической дозе однократно или в течение 2 нед., определяя уровень пролактина в плазме крови радиоиммунологическим методом.
Заключение
Применение широкого набора тестов поведенческого, радиолигандного и биохимического анализа позволяет с достаточно высокой степенью вероятности выявить соединения, обладающие антипсихотическим эффектом, и предсказать особенности их действия в клинических условиях.
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1. Бондаренко Н.А. Избирательный эффект нейролептиков на нарушение дофамин-зависимого поведения у крыс в тесте экстрополяционного избавления // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1990, №11. — С. 506–508.
2. Давыдова А.И., Клодт П.М., Кудрин В.С., Кузнецова Е.А., Наркевич В.Б. Нейрохимическое изучение эффектов афобазола и ладастена на синтез и метаболизм моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс Вистар в условиях введения ингибитора декарбоксилазы ароматических кислот NSD-1015 // Экспер. и клинич. фармакол., 2010. — Т. 73. — №3. — С. 38–42.
3. Benveniste H., Hüttemeier P.C. Microdialysis —theory and application. Prog Neurobiol., 1990. — V. 35. — P. 195–215.
4. Brodie B.B., Shore P.A., Silver S.L. Potentiating action of chlorpromazine and reserpine. Nature, 1955. — V. 175. — P. 1133–1134.
5. Costall B., Naylor R.J. On catalepsy and catatonia and the predictability of the catalepsy test for neuroleptic activity. Psychopharmacol (Berl.), 1974. — V. 34. — P. 233–241.
6. Faedda G., Kula №., Baldessarini R.J. Pharmacologogy of binding 3H-SCH-23390 to D-1 dopaminergic receptor sites in rat striatal tissue. Biochem. Pharmacol., 1989. — V. 38. — P. 473–480.
7. Geyer MA, Krebs-Thomson K, Braff DL, Swerdlow NR. Pharmacological studies of prepulse inhibition
models of sensorimotor gating defi cits in schizophrenia: a decade in review. Psychopharmacology
(Berl), 2001. — V. 156. — P. 117–154.
8. Leysen J.E., Niemegeers J.E., Van Nueten J.M., Laduron P.M. [3H] Ketanserin (R 41 4680, a selective 3H- ligand for serotonin2 binding sites: binding properties, brain distribution, and functional role. Mol.Pharmacol., 1982. — V. 21. — P. 301–314.
9. Millan M.J., Dekeyne A., Rivet J.-M., Dubuff et T., Lavielle G., Brocco H. S33084, a Novel, Potent, Selective, and Competitive Antagonist at Dopamine D3-Receptors: II. Functional and Behavioral Profi le Compared with GR218,231 and L741,626. JPET, 2000. — V. 293. — № 3. — P. 1063–1073.
10. Morpurgo C. Eff ects of antiparkinsonian drugs on a phenothiazine-induced catatonic reaction. Arch.
Int. Pharmacodyn., 1962. — V. 137 (1–2). — P. 92–96.
11. Paxinos G., Watson C., The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 5th ed., Elsevier Academic Press
Amsterdam, Boston, 2005.
12. Rydelek-Fitzgerald L., M. Teitler, Fletcher P.W., Ismaiel A.M., Glennon R.A. NAN-190: agonist and antagonist interactions with brain 5-HT1A receptors. Brain Res, 1990. — V. 532. — P. 191–196.
13. Swerdlow №.R., Geyer M.A. Clozapine and haloperidol in an animal model of sensorimotor gating defi cits in schizophrenia. Pharmacol. Biochem. Behav., 1993. — V. 44. — P.741–744.
14. Sun W., Ginovart №., Ko F., Seeman P., Kapur S. In vivo Evidence for Dopamine-Mediated Internalization of D2-Receptors after Amphetamine: Diff erential Findings with [3H]Raclopride versus [3H]Spiperone. Mol. Pharmacol., 2003. — V. 63. — P. 456–462.
15. Vasse M., Protais P., Costentin J., Schwartz J.-C. Unexpected potentiation by discriminant benzamide
derivates of stereotyped behaviors elicited by dopamine agonists in mice. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol., 1985. — V. 329. — P.108–116.
16. Vogel H.G. Drug discovery and evaluation: pharmacological assays. Sрringer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, 2008. — P. 715–774.
| 
