Буферные растворы и их приготовление

Химические процессы, протекающие в тканях организма, особенно с участием ферментов, требуют наличия ряда условий, среди которых важное значение имеет рН среды. Как известно, степень кислотности данного раствора зависит от концентрации ионов Н+ , а степень его щелочно­сти — от концентрации ионов ОН-.

При определенной температуре произведение положи­тельно и отрицательно заряженных ионов -величина постоянная. Зная один из показателей, можно определить другой. Исходя из этого положения, в химии принято обозначать кислотность или щелочность раствора условно через водородный показатель (рН), представляющий лога­рифм концентрации ионов Н+ , взятый с обратным знаком. Так, при рН 7,0 концентрация ионов Н+ равна концентрации ионов ОН- и раствор имеет нейтральную реакцию. Чем показатель рН меньше 7,0, тем концентрация ионов Н+ выше (ведь показатель с обратным знаком) и тем больше кислотность раствора. Наоборот, чем рН больше 7,0, тем меньше ионов Н+ в растворе и более выражены его щелочные свойства.

Различные ферменты требуют для проявления своей активности разные значения рН.

Так, оптимальное условие для действия щелочной фосфатазы при рН 9,0, тогда как для кислой фосфатазы требуется рН 5,0.


Чтобы обеспечить наилучшие условия для проявления активности гистохимически выявляемого фермента, необходимо, чтобы в среде инкубации поддерживалось значение рН, оптимальное для данного фермента. Это условие достигается введением в среду инкубации буферных смесей с заданными значениями рН. Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.


Приготовление буферных растворов

Прежде чем дать прописи буферных смесей, необходимо напомнить, что для определения концентрации растворов реактивов приняты понятия молярность (М) и нормальность (N).

Молярность раствора (М) — количество грамм-молей вещества, содержащихся в 1 л раствора. Грамм-моль — молекулярная масса данного вещества, выраженная в граммах. Например, для приготовления раствора в концентрации 0,2 М необходимо на 1 л раствора взять вещество в количе­стве, равном 0,2 его молекулярной массы.

Нормальность (N) — количество грамм-эквивалентов в 1 л раствора.

Грамм-экивалент — количество данного вещества, химически равноценное в данной реакции 1 грамм-атому водорода.

Для сложных веществ - это количество вещества, соответствующее прямо или косвенно при химических превращениях 1 грамму водорода или 8 граммам кислорода.

Поэтому:

Эоснования = Моснования / число замещаемых в реакции гидроксильных групп

Экислоты = Мкислоты / число замещаемых в реакции атомов водорода

Эсоли = Мсоли / произведение числа катионов на его заряд

Пример

Э H2SO4 = М H2SO4 / 2 = 98 / 2 = 49 г

Э Ca(OH)2 = М Ca(OH)2 / 2 = 74 / 2 = 37 г

Э Al2(SO4)3 = М Al2(SO4)3 / (2· 3) = 342 / 2= 57 г

Фосфатный буфер (рН 6,0—8,0).

Растворы:

А — 0,2 М КН2 РО4 (13,6 г соли в 1 л дистиллированной воды);

Б — 0,2 М Na2 НР04 (31,2 г Na2 НРО4 . 2Н2 О в 1л ди­стиллированной воды).

Для получения 100 мл буфера нужного рН следует слить растворы Аи Б в количествах, указанных в табл. 1.


Таблица 1


pH

6,0

6,5

7,0

7,2

7,4

7,6

8,0

Раствор, мл

А Раствор, мл

87,9

68,7

48,8

27,4

18,2

11,5

3,1

Б Раствор, мл

12,1

31,3

51,2

72,6

81,8

88,5

96,9



Ацетатный буфер (рН 3,6—5,6).

Растворы:

А — 0,5N СН3 СООН (30 мл ледяной уксусной кислоты долить к 970 мл дистиллированной воды);

Б — O,5N CH3 COONa (68 г соли  растворить  в   1 л  дистиллированной  воды).  

Слить растворы А и Б в количествах, указанных в табл. 2.

Таблица 2


рH

3,6

3,8

4,0

4,2

4,4 

4,6 

4,8 

5,0 

5,2

5,4 

5,6

Раствор, мл

А

185

176

164

147

126

102

80

59

42

29

19

Б

15

24

36

53

74

98

120

141

158

171

181


Трис-буфер (рН 7,2 — 9,0).

Растворы:

А — 0,2 М трис (оксиметил)-аминометана (24,3 г соли в 1 л дистиллиро­ванной воды);

Б — 0,1N НСI.

Слить указанные количества растворов А и Б и долить до 100 мл дистиллированной водой (табл. 3).

Как исходные растворы, так и сами буферные смеси могут храниться длительное время. Однако во избежание ошибок (качество реактивов, неточность при составлении)

Таблица 3


РН

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

8,5

9,0

Раствор, мл


Раствор А

25

25

25

25

25

25

25

Раствор Б

43

40

35,7

30,6

25

12

5

Вода дистиллированная

32

35

39,3

44,4

50

63  

70


0,1 М ФОСФАТНЫЙ БУФЕР, pH 5,7—8,0

МАТОЧНЫЙ РАСТВОР               "

А) 0,2М раствора NaН2Р04*Н20 (27,58 г/1000мл)

Б) 0,2 М раствора Na2НР04 (28,38 г/1000 мл)

Х мл раствора А + Y мл раствора В + Дистиллированная вода до 200мл


рH

А

Б

5,7

93,5

6,5

5,8

92,0

8,0

5,9

90,0

10,0

6,0

87,7

12,3

6,1

85,0

15,0

6,2

81,5

18,5

6,3

77,5

22,5

6,4

73,5

26,5

6,5

68,5

31,5

6,6

62,5

37,5

6,7

56,5

43,5

6,8

51,0

49,0

6,9

45,0

55,0

7,0

39,0

61,0

7,1

33,0

67,0

7,2

28,0

72,0

7,3

23,0

77,0

7,4

19,0

81,0

7,5

16,0

84,0

7,6

13,0

87,0

7,7

10,5

90,5

7,8

8,5

91,5

7,9

7,0

93,0

8,0

5,3

94,7

7,9

7,0

93,0

8,0

5,3

94,7


Примечание.

Если требуется приготовить буферный раствор иной молярности, чем указано в настоящем руководстве, то следует изменить лишь молярность исходных растворов, количественные же их соотношения для получения рН остаются неизменными.

рН приготовленных буферных растворов перед употреблением следует проверять. Грубая проверка может быть осуществлена с помощью индикаторной бумаги, более точная — посредством специального прибора-потенциометра (рН-метр).




Phosphate Buffered Saline (PBS)


10X PBS (0.1M PBS, pH 7.4):

       Na2HPO4 (anhydrous) ----------------------- 10.9 g

       NaH2PO4 (anhydrous) ----------------------- 3.2 g

       NaCl ------------------------------------------- 90 g

       Distilled water ------------------------------- 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 7.4

       Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.

 

20X PBS (0.2M PBS, pH 7.4):


       NNa2HPO4 (anhydrous) -------------------- 21.8 g

       NaH2PO4 (anhydrous) ---------------------- 6.4 g

       NaCl ------------------------------------------ 180 g

       Distilled water ------------------------------ 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 7.4

       Store this solution at room temperature. Dilute 1:20 with distilled water before use and adjust pH if necessary.


10X PBS-Tween 20 (0.1M PBS, 0.5% Tween 20, pH 7.4):


       Na2HPO4 (anhydrous) ------------------------ 10.9 g

       NaH2PO4 (anhydrous) ------------------------ 3.2 g

       NaCl -------------------------------------------- 90 g

       Distilled water -------------------------------- 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 7.4 and then add 5 ml of Tween 20

       Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.


20X PBS-Tween 20 (0.2M PBS, 1% Tween 20, pH 7.4):


       Na2HPO4 (anhydrous) ---------------------- 21.8 g

       NaH2PO4 (anhydrous) ---------------------- 6.4 g

       NaCl ------------------------------------------ 180 g

       Distilled water ------------------------------ 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 7.4 and then add 10 ml of Tween 20

       Store this solution at room temperature. Dilute 1:20 with distilled water before use and adjust pH if necessary.


Note: PBS buffer is used for routine immunohistochemiscal staining. PBS is often used for diluting secondary antibodies or streptavidin-HRP conjugate. PBS-Tween 20 is often used for washing steps.


=========================================================================


Tris Buffered Saline (TBS)


10X TBS (0.5M Tris Base, 9% NaCl, pH 8.4):


       Trizma base ------------------------------- 61 g

       NaCl ---------------------------------------- 90 g

       Distilled water ---------------------------- 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 8.4 using concentrated HCl.

       Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.

      

20X TBS (1M Tris Base, 18% NaCl, pH 8.4):


       Trizma base -------------------------------- 122 g

       NaCl ----------------------------------------- 180 g

       Distilled water ----------------------------- 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 8.4 using concentrated HCl.

          Store this solution at room temperature. Dilute 1:20 with distilled water before use and adjust pH if necessary.


10X TBS-Tween 20 (0.5M Tris Base, 9% NaCl, 0.5% Tween 20, pH 8.4):


       Trizma base -------------------------------- 61 g

       NaCl ----------------------------------------- 90 g

       Distilled water ----------------------------- 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 8.4 using concentrated HCl and then add 5 ml Tween 20.

       Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.


20X TBS-Tween 20 (1M Tris Base, 18% NaCl, 1% Tween 20, pH 8.4):


       Trizma base -------------------------------- 122 g

       NaCl ----------------------------------------- 180 g

       Distilled water ----------------------------- 1000 ml

       Mix to dissolve and adjust pH to 8.4 using concentrated HCl and then add 10 ml Tween 20.

       Store this solution at room temperature. Dilute 1:20 with distilled water before use and adjust pH if necessary.


Note: TBS is used for immunohistochemical staining when background is high or when alkaline phosphatase conjugated antibodies are used. TBS is often used for diluting secondary antibodies or streptavidin-AP conjugate. TBS-Tween 20 is often used for washing steps.


Яндекс.Метрика