Выявление нуклеиновых кислот


Нуклеиновые кислоты (высокомолекулярные соединения сложного химического состава) играют чрезвычайно важную роль в обеспечении жизнедеятельности любой животной и растительной клетки. Рибонуклеиновая кислота (РНК) осуществляет синтез белков, а дезоксирибонуклеиновая (ДНК) — хранение и передачу наследственных призна­ков. Первая содержится в цитоплазме и ядрышках, вто­рая — в хроматине ядер. Столь важная роль нуклеиновых кислот является причиной большого интереса к изучению их содержания и распространения в органах и тканях орга­низма. Существует несколько способов гистохимического выявления нуклеиновых кислот, но наибольшее распростра­нение получил метод Браше (для выявления РНК) и метод Фельгена (для выявления ДНК).

Выявление РНК по методу Браше

(фиксаторы могут быть различные, но наилучшие Карнуа,

Бродского и Ценкера; заливка в парафин)

В настоящее время этот метод во многом утратил свое бы­лое важное значение в связи с тем, что результат реакции не поддается количественной оценке на цитоспектрофотомётре. Вместе с тем данный метод еще довольно широко применяется в лабораториях (особенно, где нет цитоспектрофотометров) и само его освоение дает навык лаборанту в приготовлении и очистке химических растворов.

Сущность метода заключается в избирательном присое­динении некоторых основных красителей к нуклеиновым кислотам (при настоящем методе — пиронина к РНК и метилового зеленого к ДНК).

Прежде чем приступить к гистохимической реакции, необходимо произвести очистку метилового зеленого, так как имеющийся в продаже препарат всегда содержит при­месь метилового фиолетового, значительно искажающего результат окраски. Для этого к водному раствору метилово­го зеленого добавляют хлороформ (или амиловый спирт) и, закрыв сосуд, энергично встряхивают. После того как смесь отстоится, в ней отчетливо видны два слоя — темный верхний, представляющий водный раствор красителя, и нижний фиолетовый — хлороформ, окрашенный метило­вым фиолетовым. Слив осторожно водный раствор, к нему вновь добавляют хлороформ и повторяют всю процедуру. Отмывание производят до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться в фиолетовый цвет. Очищенный и высушенный препарат может храниться длительное время.

Рабочие растворы

Раствор А: 5% водного раствора пиронина 17,5 мл, 2% водного раствора метилового зеленого 10 мл, воды дистил­лированной 250 мл.

Раствор Б: 0,5М ацетатный буфер с рН 4,8.

Перед употреблением сливают равные объемы раство­ров А и Б (хранить не более недели).

Метод.

1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.

2.  Поместить в раствор метилового зеленого — пирони­на (от 100 мин до 20 ч).

3.  Промыть в течение нескольких секунд в дистиллиро­ванной воде (увеличение сроков промывки приводит к вымы­ванию пиронина).

4.  Высушить фильтровальной бумагой.

5.  Быстро провести через абсолютный ацетон, смесь из равных частей ацетона и ксилола, 10% раствор ацетона в ксилоле.

6. Просветлить в двух порциях ксилола и заключить в бальзам.

Результат. РНК ядрышек и цитоплазмы ярко-красного цвета, хроматин ядер зеленый или сине-зеленый.

В целях проверки специфичности окрашивания на РНК ставят параллельно контрольную гистохимическую реакцию. Для этого путем специальной обработки из срезов удаляют РНК, после чего производят окрашивание метиловым зеленым — пиронином по описанной выше схеме.

Результат. Окраска пиронином не происходит, метиловым зеленым — ослаблена.

Наилучшим способом удаления РНК является обработка срезов ферментом рибонуклеазой (0,1—0,5 мг кристалличе­ской рибонуклеазы в 1 мл дистиллированной воды) в течение 2—3 ч при 56°С.

Приотсутствии рибонуклеазы можно произвести экстракцию РНК, помещая срезы в 10 % раствор холодной хлорной кислоты (HCIO4) на 3-4 ч.


Выявление ДНК по методу Фельгена

(фиксаторф различные, но лучше Карнуа, Ценкера; заливка в парафин)

Сущность метода заключается в том, что продукты расщепления молекулы ДНК, осуществляемого  в слабокислой среде, взаимодействия с бесцветной фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа ), образует комплекс, обладающий пурпурной окраской. Таким образом, локализация продукта гистохимической реакции указывает местонахождение ДНК, а интенсивность окраски- ее концентрацию.


Приготовление растворов


Реактив Шиффа.

Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды и, периодически встряхивая сосуд с раствором, продолжают кипячение в течение 5 мин. Затем охладив содержимое до 50°С, раствор фильтруют, добавляют 20 мл 1N раствора НСI и охлаждают до 25°С, после чего добавляют 1 г метабисульфита натрия (Na2S2O5 ) или калия (K2S2O5) и оставляют в темноте. Через 18—24 ч в раствор всыпают 2г активированного угля, встряхивают в течение 1 мин, отфильтровывают и хранят в темноте при 0—4°С. Готовый реактив Шиффа бесцветен или имеет светло-желтую окраску. Покраснение раствора в процессе хранения свидетельствует о его разложении и непригодности к употреблению.

Необходимо иметь в виду, что иногда в продажу поступает недостаточно очищенный основной фуксин. Поэтому если приготовленный раствор не отвечает предъявляемым требованиям, нужно взять основной фуксин из новой партии и вновь приготовить реактив.

Однонормальный раствор хлористоводородной кислоты (1N).

К 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,19) добавляют 90 мл дистиллированной воды. Раствор может храниться длительное время.

Сернистокислая вода для промывки срезов.

К 5 мл 10% бисульфита калия (K2S2O5 ) добавляют 5 мл 1N раствора НСI и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Раствор бисульфита калия можно применять в течение 7 дней, сернистокислую же воду готовят перед употреблением и применяют однократно.


Метод.

1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.

2. Быстро ополоснуть в холодной 1N HC1.

3. Поместить в 1N HC1 при 60°С на 6мин (стаканчик ставят в водяную баню).

4. Быстро ополоснуть в холодной 1N  HC1, а затем в дистиллированной воде.

5. Поместить в реактив Шиффа на 40—60 мин.

6. Осушить  фильтровальной  бумагой и ополоснуть  в трех порциях свежеприготовленной сернистокислой воды по 1—2 мин в каждой.

7.  Промыть в водопроводной воде до 10 мин (если нужно докрасить цитоплазму: срез помещают на 1—1,30мин в 1% водный раствор светлого зеленого  или 0,5% спиртовой раствор прочного зеленого).

8. Обезводить, просветлить и заключить в бальзам.

Результат.

Участки ядер, содержащие ДНК, окрашиваются в красновато-пурпурный цвет(цитоплазма светло-зеленая).



Яндекс.Метрика