Гистохимия нервной системы

Гистохимия нервной системы

За последние годы в гистологических лабораториях широко применяются нейрогистохимические методы, которые в отличие от классических нейрогистологических методов дают

возможность выявить функциональную характеристику элементов различных отделов нервной системы. Наиболее распространенные и доступные из них — это методы определения холинергических и адренергических компонентов.

Метод выявления  адренергических  компонентов  нервной системы

(метод Фалька — Хилларпа без лиофилизации)1

1 Данный метод пригоден для выявления адренергических нервных волокон во всех органах, за исключением головного мозга и печени; для ра­боты с этими тканями необходимо после замораживания применение лио-фильной сушки кусочков и пропитывание парафином в вакууме

Метод основан на способности катехоламинов флюоресцировать после обработки парами параформальдегида в проходящем ультрафиолетовом луче. В результате структуры, содержащие катехоламины, светятся желто-зеленым светом. Следует отметить, что данный метод является специфичным не только для нервной системы, но и для других тканей организма, содержащих катехоламины (мозговое вещество надпочечников и др.).

Приготовление параформальдегида определенной влажности.

В зависимости от требуемой влажности параформальдегида на дно эксикатора наливают серную кислоту определенной концентрации. Параформальдегид, находящийся в чашке, выдерживают в эксикаторе на подставке в течение 7—10 дней.

Для большинства органов рекомендуется параформальдегид 60% влажности.

Метод.

1. Кусочки исследуемого органа замораживают сухим льдом.

2. В криостате приготавливают срезы толщиной 15—30 мкм (в зависимости от органа), которые переносят на стекла и высушивают в потоке теплого воздуха в течение 5—7 мин.

3. Устанавливают стекла в штатив и помещают в стеклянный сосуд объемом 1 л, на дно которого насыпают 5—6 г параформальдегида, имеющего соответствующую влажность, после чего сосуд плотно закрывают и ставят в термостат с температурой + 80°С на 60 мин. Срезы извлекают и заключают в жидкий парафин (вазелиновое масло) и исследуют в люминесцентном микроскопе с использованием светофильтров СЗС-14-4, ФС-14, ФС-1-2 и запирающего светофильтра ЖС-18 (до и после просмотра стекла обязательно должны храниться в темноте во избежание угасания флюоресценции).

Для проведения контроля реакции на специфичность часть стекол со срезами нагревают в термостате в стеклянном цилиндре без параформальдегида в тех же условиях.

Метод выявления холинергических компонентов нервной системы (метод Карновского)

В отличие от предыдущего метода, основанного на прямом выявлении катехоламинов в тканях, данный метод базируется на выявлении активности фермента ацетилхолинэстера-зы, который катализирует процесс расщепления нейромедиатора ацетилхолина в месте его локализации (нейроцит и его отростки). Выявление структур происходит в результате выпадения окрашенного продукта реакции фермент—субстрат.

Приготовление инкубационной среды

Для приготовления инкубационной среды применяют следующие растворы.

l.

a)0,2MNaOH:0,8г NaOH+100мл Н2О.

б) 0,2М NaH-малеиновая соль (раствор):

2,32 г малеиновой кислоты+60,0 мл Н2 О + 0,8 г NaOH и доведение до 100 мл.

Из двух растворов приготавливают первый рабочий раствор: 26,9 мл 0,2М NаОН+50,0мл 0,2М NaH-малеиновая соль+Н2О до 200мл.

2.  Цитрат натрия 0.1М : 2,59 г Na3C6H5O7+100 мл Н2О.

3.  CuS04 . 6Н2О : 0,375г CuSO4+50,0 мл Н2 О.

4. Красная кровяная соль: 0,083 г K3Fe(CN)6+50,0мл Н2О.

Инкубационную среду готовят перед употреблением, смешивают в указанной ниже последовательности и хорошо встряхивают.

Ацетилтиохолинйодида -10 мг

Кислого малеиновокислого-Na 0,2 М(рН 6,05)-13 мл

Цитрата натрия 0,1 М-1 мл

CuSO4 30 М-2 мл

Дистиллированной воды-2мл

K3Fe(CN)6 5М-2 мл

В контроле вместо ацетилтиохолинйодида применяют бутирилтиохолинйодид и той же концентрации.

Метод.

1. Кусочки исследуемого органа (размер 3x3 мм) фиксировать в течение 2,5—3,5 ч при температуре + 2—I- 4°С в 4% растворе формалина, забуференного до рН 7,6 при помощи 0.075М фосфатного буфера, содержащего 0,44 М сахарозу.

2. Промокнуть и поместить в 0,044 М сахарозу при температуре +2— +4°С на 15—16ч,   после чего вновь промокнуть и быстро заморозить сухим льдом.

3.  Нарезать срезы в криостате (толщиной 1— 30мкм), перенести на стекла, подсушить на воздухе и поместить в инкубационную среду на 60 мин (при температуре +37°С).

4. Перенести  стекла со срезами в стаканчик с 10% формалином, приготовленным на изотоническом растворе хлорида натрия, на 10 мин.

5.  Ополоснуть в двух порциях дистиллированной воды, подкрасить кармином и заключить, как обычно, в канадский бальзам.

Результат.

Холинергические компоненты, цитоплазма нейроцитов и нервные волокна окрашиваются в коричневый цвет, интенсивность которого прямо пропорциональна активности фермента.