Приготовление сред для культивирования клеток

Приготовление солевых растворов и

питательных сред для культивирования клеток

Питательные среды.

В любой клеточной культуре различают клеточную и жидкую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность клеток культуры и представляет собой питательные среды различного состава и свойств.

Все среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных элементов в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вирусных агентов.

Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут входить как естественные продукты (амниотические жидкости, сыворотки животных), так и субстраты, полученные в результате частичной обработки естественных продуктов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические химически чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).

В качестве примера питательной среды, полностью состоящей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян. В эту среду входит коровья амниотическая жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и коровий эмбриональный экстракт (5%).

Все естественные продукты малостандартны, их использование связано с большой опасностью микробной и вирусной контаминации клеточных культур. В связи с этим и происходит постепенное вытеснение их синтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные количества солей, аминокислот и витаминов.

Независимо от назначения все питательные среды для тканевых культур конструируются на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора с достаточной буферной емкостью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы — обязательный компонент любой питательной среды. Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит.

Включение сыворотки в то же время препятствует созданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных исследований по клеточной физиологии, так как вместе с сывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьирующих в зависимости от серии сыворотки.

В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессывороточные среды точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлением сывороток. В  связи с этим  представляет интерес работа Birch  и Pirt,  показавших,  что для  обеспечения  интенсивного  роста клеток в бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС12.

В ростовые питательные среды, а так же в буферный раствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500 мл среды.

Ниже приведен состав и метод приготовления одной из распространенных питательных сред, среды Игла.

Приготовление солевых растворов и питательных сред для культивирования клеток

а) Солевые растворы

Для приготовления питательных сред применяют физиологические солевые растворы, функция которых заключается в сохранении рН, осмотического давления среды и в обеспечении клеток необходимыми неорга­ническими веществами. Растворы готовят из химически чистых солей на высокоочищенной воде, свободной от ионов тяжелых металлов, токсич­ных для клеток. Используют дистиллированную воду, дважды перегнан­ную в стеклянных аппаратах, или воду, полученную в ионообменных колонках, нейтральной реакции. Воду получают в день приготовления растворов или накануне и хранят в стерильном стеклянном сосуде под резиновой пробкой на холоде. Предложены различные Прописи сбалансированных солевых раство­ров, но наиболее часто употребляют из-за простоты получения растворы Хенкса и Эрла. Для приготовления каждого раствора вначале готовят 10-кратные концентраты всех компонентов (основной раствор). Для этого в градуированную бутыль емкостью 1 л наливают 700—800 мл бидистиллированной воды и растворяют последовательно (во избежание образования труднорастворимых осадков) следующие химически чистые соли  (в граммах).

Для предупреждения выпадения осадка раствор хлористого кальция готовят отдельно и медленно добавляют к раствору остальных солей после полного их растворения.

Каждый полученный основной раствор доводят бидистиллированной водой до 1 л, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 20 минут 3 дня подряд или пропусканием через стерилизующие фильтры.

Для приготовления рабочих растворов в необходимом объеме концентраты разводят в 10 раз стерильной бидистиллированной водой; рН рабочего раствора Хенкса доводят до 7,2—7,4, а Эрла — до 7,4—7,6 подщелачиванием двууглекислой содой (NaHC03), необходимое количество которой предварительно вытитровывают на 10—100 мл рабочих растворов по цветной шкале. В случае перещелачивания рабочий раствор Хенкса подкисляют уксусной кислотой, а через раствор Эрла для подкис-ления пропускают углекислый газ из баллона или аппарата Кипа. Раствор Эрла обладает большей буфериостью, чем раствор Хенкса. Срок годности основных и рабочих растворов Хенкса и Эрла без бикарбоната при хранении в рефрижераторе (2—4°) 1 год. В случае необходимости рабочие растворы стерилизуют так же, как и основные.

б) Питательные среды

Питательная среда для культивирования клеток должна иметь солевой состав, близкий к таковому животного организма, определенную концентрацию водородных ионов (рН), быть изотоничной и содержать необходимые для жизнедеятельности клеток питательные вещества: аминокислоты, углеводы, витамины и факторы роста.

Нормальный рост и размножение клеток вне организма могут происходить как в естественных, так и в искусственных, синтетических питательных средах, обогащенных стимулирующими биологическими жидкостями, такими, как сыворотка крови, эмбриональный экстракт и др. Среды, обеспечивающие активное размножение клеток, называют ростовыми средами, а синтетические среды, не содержащие естественных стимулирующих продуктов или содержащие их в минимальном количестве, способные в основном только поддерживать жизнеспособность, переживание клеток, называют поддерживающими средами.

Естественные питательные среды.

Естественные питательные среды являются наиболее дешевыми и полноценными для культивирования клеток. Их приготовляют из сыворотки человека или животных, эмбрионального экстракта, амниотической жидкости и сбалансированных солевых растворов в различных соотношениях и используют для выращивания вновь изолированных и очень прихотливых клеток.

Сыворотка является важнейшей составной частью всех питательных ростовых сред. Для культивирования клеток наиболее часто используют сыворотку человека, коров, лошадей, реже — овец, кроликов и кур. Используют также сыворотку плацентарной крови человека. Сыворотку проверяют на стерильность, при необходимости фильтруют и применяют инактивированной прогреванием (при 56° 30 минут) или непрогретой. Сыворотку хранят в ампулах или пробирках под резиновыми пробками при температуре 2—4°, а в случае длительного хранения, учитывая нестабильность глютамина, замораживают при —15—20°. Некоторые индивидуальные сыворотки оказываются токсичными, вызывают склеивание, дегенерацию клеток и непригодны для их культивирования. Поэтому каждую свежеполученную сыворотку следует проверять на токсичность путем внесения в культуры клеток параллельно с добавлением в контрольные культуры известной нетоксичной сыворотки. Токсичность сыворотки может быть ослаблена смешиванием нескольких индивидуальных сывороток. Сыворотка плацентарной крови не обладает токсическим действием. Используют эти среды редко.

Для культивирования клеток используют также ферментативные гидролизаты белковых веществ: лактальбумина, казеина и белка крови крупного рогатого скота или человека (отходы производства гамма-глобулина).

Наиболее широкое применение получил ферментативный гидролйзатом лактальбумина, содержащий все незаменимые аминокислоты и витамины.

Это так называемые полусинтетические питательные среды.

Среду с энзиматическим гидролизатом лактальбумина можно приготовить следующим образом: 5 г сухого гидролизата лактальбумина растворяют в 100 мл основного раствора Хенкса или Эрла (10-кратные концентраты), дополняют объем до 1 л бидистиллированной водой и вносят антибиотики (по 100—200 ЕД пенициллина и стрептомицина и 20 ЕД нистатина на 1 мл среды). Подщелачивание производят NaHC03; рН среды, приготовленной на растворе Хенкса, устанавливают 7,2—7,4, а приготовленной на растворе Эрла — 7,4—7,6. Среду стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца. 0,5% раствор гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса с добавлением в различной концентрации сыворотки человека, коров или лошадей применяют для выращивания первично трипсинизированных и некоторых перевиваемых клеток, а на растворе Эрла без сыворотки или с минимальным ее количеством — для поддержания тех же культур, зараженных вирусами. Срок годности среды при хранении в холодильнике  1 год.

Ферментативный гидролизат белков цельной крови крупного рогатого скота выпускается под названием «аминопептид-2». Аминопептид-2 содержит все незаменимые аминокислоты и в качестве их источника вводится в питательные среды для культивирования клеток.

В табл. 3 приведены рецепты питательных сред, содержащих ферментативный гидролизат лактальбумина и аминопептид-2 и применяющихся для выращивания первичных и перевиваемых культур клеток.

Таблица 3

СОСТАВ НЕКОТОРЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Удовлетворительные результаты при выращивании первичных и перевиваемых линий клеток получают с питательной,средой, выпускаемой Белорусским ИЭМГ. Ее основой является 5% гемогидролизат — продукт ферментативного расщепления сгустков крови крупного рогатого скота или человека (отходы производства гамма-глобулина) и 5 витаминов в растворе Хенкса. К среде добавляют 10% сыворотки крупного рогатого скота.

Синтетические питательные среды.

Преимуществом синтетических питательных сред является их строго определенный состав, что позволяет стандартизовать условия эксперимента. В настоящее время разработаны прописи ряда синтетических питательных сред (199, 703, 858, среда Игла и др.), содержащих аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества, необходимые для поддержания жизнедеятельности клеток вне организма. Однако для выращивания полноценных культур клеток ко всем предложенным синтетическим средам необходимо добавлять сыворотку. Для культивирования клеток широко применяется среда 199, предложенная Morgan, Morton и Parker. Приготовление среды довольно сложное. Она может быть приобретена в готовом виде. Для выращивания клеток среду 199 используют с добавлением 5—10% коровьей или лошадиной сыворотки, а для поддержания зараженных вирусами культур клеток - без сыворотки или с добавлением 2% ее. Срок годности среды при хранении в холодильнике 1 год.

в)  Прочие  растворы, используемые при  культивировании  клеток

Раствор бикарбоната натрия.

Для нормальной жизнедеятельности клеток в питательных средах необходимо поддерживать концентрацию водородных ионов в пределах 7,2—7,4. Оптимальное значение рН устанавливают с помощью бикарбоната натрия (NaНСОз), который играет роль буферной системы. Для подщелачивания среды применяют 1,4; 5 и 8% растворы NaHC03. Для приготовления 1 л указанных растворов берут соответственно 14, 50 и 80 г двууглекислого натрия и бидистиллированной воды до 1000 мл. Растворы фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 20 минут 3 дня подряд в стеклянной посуде под ватно-марлевыми пробками или пропусканием через стерилизующие фильтры. После стерилизации раствор двууглекислой соды хранят под резиновыми пробками в холодильнике или при комнатной температуре и используют в течение месяца.

Раствор фенолового красного.

Для индикации рН солевых растворов и питательных сред к ним добавляют в конечной концентрации 0,002% феноловый красный.

Цветная шкала буферных растворов.

Для определения значения рН среды по цвету индикатора пользуются цветной шкалой, которую готовят следующим образом.

Из химически чистых Na2НР04* 2Н20 и КН2Р04, высушенных до постоянного веса (первая при температуре 37°, вторая при 110°), готовят отдельно 1/5 М растворы. Для этого 11,871 г Na2HP04*2H20 и 9,076 г КН2Р04 растворяют каждую в 1 л воды.

Для получения смесей с разным значением рН растворы солей соединяют в определенных количествах (табл. 4). В каждую смесь добавляют по 3 капли 0,1% раствора фенолового красного. Смеси хранят в пробирках под резиновыми пробками, залитыми парафином. При длительном хранении индикатор обесцвечивается, и цветную шкалу готовят заново.

Определять рН среды по цвету индикатора можно и при помощи бумажной цветной шкалы.

Точное значение рН среды устанавливают потенциометром.

Растворы антибиотиков.

Контаминаяция культур клеток

Для бактериологической стерильности в солевые растворы и питательные среды вводят антибиотики: пенициллин (натриевая соль), стрептомицин (хлоркальциевый комплекс) и микостатин (нистатин). Пенициллин и стрептомицин добавляют в солевые растворы и питательные среды при их изготовлении из расчета 100—200 ЕД каждого на 1 мл среды. Учитывая, что при длительном хранении солевых растворов и питательных сред эти антибиотики инактивируются, их добавляют в той же концентрации в среды непосредственно перед применением. Микостатин вносят в среды при их приготовлении из расчета 20—25 ЕД на 1 мл. Микостатин в количестве 1 млн. ЕД растворяют в 25 мл 80° этилового спирта путем энергичного встряхивания при комнатной температуре. Раствор фильтруют через малый фильтр Зейтца и добавляют по 0,5 мл на 1 л среды, что соответствует 20 единицам активности в 1 мл. Спиртовой раствор антибиотика годен в течение суток хранения в холодильнике (2—4°).

Можно применять микостатин в виде раствора в 0,1 N NaOH, содержащего в 1 мл 25 000 ЕД. Раствор антибиотика стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца и добавляют по 1 мл на 1 л среды.

В указанных концентрациях антибиотики не влияют на жизнеспособность клеток и репродукцию большинства вирусов, в больших концентрациях они могут оказаться токсичными для клеток.

Диспергирующие растворы.

Раствор трипсина

применяют для получения клеточной взвеси из органов и тканей и снятия клеток с поверхности стекла. Раствор готовят следующим образом. В 500 мл бидистиллированной воды растворяют 2,5 г трипсина. Отдельно готовят солевой раствор следующего состава.

Полученные растворы смешивают, фильтруют через ватномарлевый фильтр и стерилизуют фильтрованием. Перед фильтрацией пластины фильтра промывают стерильной бидистиллированной водой. Первую порцию профильтрованного трипсина не используют ввиду ее малой активности. Срок годности трипсина при хранении в холодильнике 2 месяца, а в замороженном состоянии при —20° 3 месяца. При длительном хранении диспергирующая активность трипсина снижается, что отрицательно влияет на качество получаемых клеток.

Раствор версена

(Натривая соль этилендиаминтетрауксусная кислоты)

применяют для снятия клеток с поверхности стекла. Он вызывает более тонкое диспергирование клеток и в меньшей степени влияет на их жизнеспособность, чем раствор трипсина. Для приготовления раствора версена ингредиенты растворяют в следующем порядке.

NaCI -8,0

КСI -0,2

NaHP04 -1,15

или Na2HPO4*2H20 -1,45

или Na2HP04*12H20 -2,9

Версен (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты)ТРИЛОН Б- 0,2

Вода бидистиллированная до -1000 мл

Раствор перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр, стерилизуют под ватно-марлевыми пробками автоклавированием 30 минут при давлении 1 атм. Срок годности версена при хранении в холодильнике 1 год; при комнатной температуре активность снижается быстрее.

г)   Приготовление  питательной среды для внесения  в культуры клеток

Все ингредиенты, из которых составляется питательная среда, должны быть предварительно проверены на бактериологическую стерильность. Контроль стерильности осуществляется путем засева проб каждого ингредиента (по 0,2—0,5 мл) в 2 пробирки с сахарным или питательным бульоном и средой Сабуро. Бульоны с посевами выдерживают в термостате (37°), а среду Сабуро — при комнатной температуре в течение 8 дней. Для составления питательной среды могут быть использованы только стерильные ингредиенты, которые соединяют в определенных пропорциях в зависимости от вида культивируемых клеток и цели эксперимента (выращивание клеток или поддержание зараженных вирусами культур клеток). В приготовленную питательную среду добавляют антибиотики (см. стр. 90) и феноловый красный так, чтобы его конечная концентрация соответствовала 0,002% (феноловый красный не до­бавляют, если основу питательной среды составляет солевой раствор, в который он был добавлен при изготовлении). рН юстируют двууглекислой содой до 7,2—7,4 для сред, основой которых является раствор Хенкса, и до 7,4—7,6 для естественных питательных сред и сред, основу которых составляет раствор Эрла. Указанные значения рН устанавливают по цвету индикатора питательной среды, ориентируясь на соответствующий цветной стандарт шкалы буферных растворов . Неизрасходованное количество применявшихся для составления питательной среды ингредиентов и приготовленной питательной среды вновь контролируют на стерильность и хранят до использования в холодильнике (2—4°). Для предупреждения улетучивания С02 и защелачивания среды солевые растворы и питательные среды, содержащие двууглекислую соду, необходимо хранить во флаконах или пробирках, плотно закрытых резиновыми пробками.