ПРОТОКОЛ. Выделение мышиного эмбриона

ПРОТОКОЛ. Выделение мышиного эмбриона

Схема

Асептически удалить матку у мыши с заданным сроком беременности и вырезать эмбрион.

Материалы

Стерильные:

•DBSS: BSS для препарирования (BSS с высокой концентрацией антибиотиков, смотри приложение I) в пробирке с закручивающейся пробкой объемом 25-50 мл или в универсальном контейнере.

•50 мл BSS в стерильном стакане (используется для охлаждения инструментов после стерилизации пламенем)

•Чашки Петри диаметром 9 см

•Остроконечные пинцеты.

•Остроконечные ножницы

Нестерильные:

•Малый шкаф с ламинарным потоком

•Мышь с необходимым сроком беременности

•70%-й спирт в промывалке

•70%-й спирт для стерилизации инструментов (см. рис. 7.4)

•Горелка Бунзена.

Требование безопасности.

При стерилизации инструментов путем погружения их в спирт и последующего прожигания следите за тем, чтобы не вернуть инструменты в спирт пока они еще горят.

Протокол

1. Индукция эструса. Если самцы и самки размещены по отдельности, поместите их вместе для спаривания. Течка у самок начнется через 3 суток. Это позволит планировать образование эмбрионов в назначенное время. Время для удачного спаривания можно определить, проверяя каждое утро жесткость и слизистую пробку влагалища.

2. Датировка эмбрионов. День выявления вагинальной пробки или «дата пробки» записывается как нулевой день, и развитие эмбриона отсчитывается с этой даты. Полный срок беременности 19-21 день. Оптимальный возраст эмбриона для получения культуры из полностью дезагрегированного эмбриона — около 13 дней, когда эмбрион уже относительно большой (рис. 12.1, 12.2), но еще содержит высокий процент недифференцированной мезенхимы, которая и является главным источником культуры клеток. Однако для изоляции и проведения манипуляций с эмбрионом после середины полного срока беременности может потребоваться лицензия (например, в Великобритании), поэтому, возможно, предпочтительней брать работать с 9-10-дневными эмбрионами. Хотя количество ткани, полученной из этих эмбрионов, будет

существенно меньше, больший процент клеток пойдет в рост. Большинство индивидуальных органов, за исключением мозга и сердца, начинают формироваться примерно на 9-й день беременности, но их трудно выделить до 11-го дня. Препарирование индивидуальных органов проще проводить на 13-14-й день. Большинство органов полностью формируются к 18-му дню.

3.Забейте мышь путем дислокации шейных позвонков (процедура описана в Правилах про¬

ведения работ I Великобритании) и обильно протрите брюшную поверхность 70%-м спиртом

(рис. 12.3а).

4. Сделайте разрез кожи с брюшной стороны перпендикулярно медиане до диафрагмы (рис. 12.36) и, сжав пальцами кожу с двух сторон разреза, потяните ее в противоположных направлениях, чтобы обнажить нетронутую вентральную поверхность стенки брюшной полости (рис. 12.3в).

5. Стерильными ножницами сделайте надрез вдоль линии медианы, обнажая внутренности (рис. 12.3г). На этой стадии матка с эмбрионом хорошо видна в тазовой области брюшной полости (рис. 12.3d).

6. Извлеките матку и поместите ее во флакон с завинчивающейся крышкой объемом 25 мл или 50 мл, заполненный 10 или 20 мл DBSS (рис. 12.3е).

Примечание. Все предыдущие этапы должны проводиться вне лаборатории культуры тканей. Малый шкаф с ламинарным потоком и быстрое проведение операций помогут обеспечить стерильность, Не приносите живых животных в лабораторию культуры тканей, так как животные могут быть контаминированы. Если с тушкой животного необходимо проводить какие-либо манипуляции в зоне работы с культурой тканей, убедитесь, что тушка была на короткое время погружена в спирт или тщательно протерта спиртом и после использования быстро удалена из помещения.

7. Перенесите интактную матку в лабораторию культуры тканей и поместите ее в новую чашку

Петри со стерильным DBSS (рис. 12.3ж).

8.Препарирование эмбрионов:

а) Вскройте матку с помощью двух стерильных пинцетов, держа концы пинцетов близко

друг к другу, чтобы избежать разрыва матки, и не давите слишком сильно на эмбрионы

(рис. 12.3 ж, з).

б) Освободите эмбрионы от оболочек (рис. 12.3и) и плаценты и поместите их с одной стороны

чашки для стекания крови.

9. Перенесите эмбрионы в новую чашку Петри. Если требуется большое количество эмбрионов (например, необходимо больше четырех или пяти пометов), может быть полезно поместить чашку на лед (для последующего препарирования и культивирования, смотри протоколы 12.4-12.8).

Рис. 12.2. Мышиные эмбрионы.

Эмбрионы на 12-й, 13-й и 14-й дни беременности.

12-дневный эмбрион (внизу) получен из малого помета (три), и он больше по размеру, чем обычно бывает на этой стадии

Рис. 12.3. Препарирование мыши.

Стадии препарирования беременной мыши для забора эмбрионов (смотри протокол 12.1).

(а) Протирание брюшной полости,

(б, в) Растягивание кожи для того, чтобы обнажить стенку брюшной полости,

(г) Вскрытие брюшной полости.

(д) Выявление местонахождения матки,

(ё) Извлечение матки,

(ж, з) Извлечение эмбрионов из матки.

(и) Удаление оболочек,

(к) Удаление головы (необязательно),

(л) Измельчение эмбриона.

(м) Перенос кусочков во флакон для трипсинизации (для тепловой трипсинизации; см. протокол 12.5).

(н) Перенос кусочков в малый флакон Эрленмайера (для холодной трипсинизации, см. протокол 12.6).

(о) Помещение флакона на лед