КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
Клеточные культуры находят все более широкое применение в разных областях биологии и медицины. Их используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов дифференцировки и пролиферации, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, биологической подвижности, злокачественной трансформации и др. Важную роль играют клеточные культуры в биотехнологии при производстве вакцин и биологически активных веществ. Культуры клеток применяют для диагностику и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ.
Использование культивируемых клеток вне организма для диагностики болезней является логическим продолжением метода биопсии, при которой изъятий из, организма фрагмент ткани подвергают немедленному (преимущественно морфологическому) исследованию. Однако благодаря культивированию возможности исследования и диагностики расширяются практически беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но также изменений в поведении клеток, их реакций на различные агенты, в том числе на лекарственные воздействия. Воспроизведение культивируемыми клетками в ряду поколений какого-либо дефекта или изменения, свойственного клеткам in vivo, свидетельствует о наследственной природе этого дефекта или изменения. Именно благодаря этому обстоятельству культивируемые клетки являются ценным объектом, физиологической генетики. В последнее время возрос интерес к работе с культивируемыми клетками, особенно у специалистов по применению моноклональных антител, получаемых методами гибридомной технологии.
Организация лаборатории культуры ткани
Технические средства, предназначенные для лаборатории культуры клеток и тканей, должны образовывать определенную систему. При подборе оборудования полезно составлять так называемые номенклатурные перечни. При этом все технические средства группируют по их месту в процессе работ с клеточными культурами:
1) приборы и устройства, обеспечивающие работу с клеточными культурами;
2) приборы и устройства для культивирования клеток;
3) микроскопы;
4) устройства для криоконсервации и хранения клеточных культур.
Приборы
Для получения сверхчистой и общелабораторной воды, используемой для приготовления питательных сред, мытья посуды, предназначенной для выращивания культур тканей и других целей, применяют установки ОВ-1, OB-2, OB-3. Установка ОВ-1 представляет собой последовательно соединенные установки ОВ-2 и ОВ-3.
В практике работ с клеточными культурами часто возникает необходимость в массовом дозировании, отборе проб или разведении биологически активных жидкостей. Величина единичной дозы в большинстве случаев находится в диапазоне от 1 мкл до 10 мл. Жесткие требования предъявляют также к точности и воспроизводимости разовой дозы. Значительно облегчает проведение этой технологической операции использование автоматических или полуавтоматических устройств, которые в разных источниках называют дозаторами-дилюторами, автоматическими пипетками и т.п. Сменные наконечники можно подвергнуть паровой стерилизации и повторно использовать.
За рубежом широко применяют устройства, относящиеся к малой лабораторной технике, не являющиеся по своей сути дозаторами, но значительно облегчающие этот процесс и делающие его более безопасным для оператора. Речь идёт о так называемых приборах «Piped-Aid»; которые предназначены для отбора проб и выдачи дозы при работе с пастеровскими пипетками и любыми градуированными пипетками емкостью до 75 мл. Пипетку вставляют в специальный держатель, соединенный с малогабаритным вакуумным насосом. Отбор проб и дозирование проводят путем создания вакуума или избыточного давления в пипетке. Оператор управляет работой прибора с помощью кнопок, размещенных на держателе. Скорость набора и выдачи дозы регулируют с помощью установки производительности наcoca или силой нажатия соответствующих кнопок управления. В данных приборах предусмотрена защита от попадания дозируемой жидкости в прибор, а также имеются воздушные фильтры, исключающие загрязнение дозируемой жидкости при выдаче дозы.
Устройства для приготовления питательных сред
Одним из основных требований к жидким питательным средам для клеточных культур является их стерильность, достигаемая, в частности, с помощью так называемой стерилизующей фильтрации, освобождающей питательные среды от примесей, бактерий и коллоидов. Различают микро- и ультрафильтрацию сред. При микрофильтрации из жидкости удаляют частицы примесей и бактерии размером от 0,25 до 10 мкм. Ультрафильтрация позволяет извлечь из раствора очень мелкие частицы и. коллоиды, а также молекулы растворенных веществ с молекулярной массой от 1000 до 1.000.000.
Мембранные фильтры, пригодные для очистки питательных сред, производят ряд фирм. Наиболее широкое применение в практике нашли миллипоровые фильтры. Размеры мембранных фильтров (13, 25, 47, 90, 142 и 293 мм) стали в какой-то мере стандартными. Для фильтрации средних по объему количеств питательных сред (25-50 л) наиболее удобны установки с мембранными фильтрами диаметром 90 и 142 мм. В общем случае установка для стерилизующей фильтрации состоит из системы, предназначенной для создания Избыточного давления на фильтруемую жидкость, стерилизуемого держателя фильтра, фильтрующей мембраны, трубопроводов и сосудов для размещения фильтруемой жидкости и фильтрата.
При подборе и расчете фильтрующей системы рекомендуется предварительно сформулировать задачу (вид среды, подлежащей фильтрации, ее температура, вязкость, химический состав, размер частиц, подлежащих фильтрации, режим фильтрации - непрерывный или порционный и т.п.) и подобрать соответствующие мембрану и держатель, а также определить величину избыточного давления, необходимого для фильтрации.
Приборы и устройства для культивирования клеток
Стерильность при работе с культурами клеток обычно достигается путем проведения исследования в так называемом боксовом помещении. Для создания боксовых помещений, как правило, необходимы значительные затраты. Альтернативой в этом случае является использование так называемых ламинар-боксов, или стерильных рабочих мест: в любом помещении может быть создан локальный стерильный объём, необходимый для работы и создающий биологическую защиту пользователей. Технически задачу решают путём постоянного, обдува места проведения работ (например, стола) ламинарным потоком воздуха, в 1 дм3 которого содержится не более 4 частиц загрязнителей величиной 0,3 — 0,5 мкм. Избыточное давление воздуха 5 рабочем объеме и специальные конструктивные меры исключают возможность попадания воздуха из помещения в то место, где расположен биологический материал. Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха типа УО-БГ, (установка обеспыливания биологическая с горизонтальным потоком) обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую зону, до необходимого уровня. Очистку производят с помощью фильтров грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор.
Ламинар-бокс типа БП-4-004 («Бокс-Р»), предназначенный для работ с потенциально патогенными культурами, обеспечивает подачу в рабочую зону ламинарного потока воздуха, в 1 дм3 которого содержится не более 3 — 4 частиц размером более 0,3 мкм. В приборе предусмотрена так называемая рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем. Благодаря этому исключается вынос обрабатываемого материала в помещение. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвращают путем создания зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бокса. Перечисленные ламинар-боксы предназначены для размещения в любых производственных помещениях, имеющих приточную вентиляцию с предварительной грубой очисткой воздуха.
Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать определенным требованиям: обеспечивать высокую стабильность заданной температуры, создавать минимальный градиент температуры по полезному объему, иметь систему быстрого восстановления температуры после кратковременного охлаждения. Внутренняя поверхность термостатов должна быть изготовлена из биологически пассивных материалов, т.е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред. Материалы, из которых изготавливают внутренние и наружные части термостата, и покрытия должны выдерживать деконтамиацию водными растворами спирта-ректификата и стерилизацию УФ-излучением.
Современные модели этих приборов имеют полезный объем от 20 до 1400 л. Полезный объем образуется полированными пластинами из нержавеющей стали или меди (у дорогих моделей). Как правило, термостаты имеют наружную и внутреннюю двери. Последнюю изготавливают из прозрачного материала, что позволяет наблюдать за содержимым термостата без нарушения температурного режима: Многие модели подобных приборов имеют секционную внутреннюю дверь, обеспечивающую доступ в термостат с минимальным нарушением теплового режима в полезном объеме. Температуру в рабочей камере термостатов обычно можно задавать в диапазоне от превышающей комнатную на 5 °С до 80 °С. В некоторых моделях термостатов имеется встроенная холодильная установка, позволяющая задавать температуру в диапазоне от -10 до 80 °С и поддерживать eё при помещении в полезный объем приборов, выделяющих дополнительное тепло, например роллерных установок, встряхивателей и т.п.
В связи с необходимостью поддержания постоянного рН питательной среды и ее минимального испарения в период инкубации клеток были созданы специальные приборы, предназначенные для этой цели, — так называемые углекислотные инкубаторы. По своей конструкции и основным параметрам они полностью соответствуют описанным выше термостатам. Основным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем.
В газовой среде камер углекислотного инкубатора повышена концентрация кислорода и углекислого газа, в большинстве случаев только углекислого газа; концентрацию задают в зависимости от условий культивирования и поддерживают автоматически с точностью до ±0,1 %. Современные модели этих приборов позволяют регулировать количество кислорода и углекислого газа в диапазоне от 1 до 95 об.%.
Известно, что принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них культурами клеток обеспечивает лучший газообмен и, следовательно, повышает эффективность культивирования. Во многих случаях этот эффект возрастает при сочетании перемешивания и поддержания температуры, oптимальной для данной культуры. Приборы, осуществляющие эту операцию, называются лабораторными встряхивателями. Конструктивно они состоят из платформы, на которой крепят сосуды, заполненные суспензией, и приводного механизма, обеспечивающего вращательное или возвратно-поступательное движение платформы. В случае необходимости платформу помещают в воздушный термостат; или водяную баню. Эти приборы относятся к сложным и дорогим техническим устройствам, что связано со специальными требованиями к их работе, основным из которых является строгое плоско-параллельное перемещение платформы без толчков и вибрации. Кроме того, при вращательном движении диаметр этого перемещения должен быть одинаков в любой точке платформы. Заданные параметры встряхивания (перемешивания) например радиус вращения, должны быть постоянными. Платформу приводят в движение с помощью электродвигателя через систему кинематических передач или путем приложения к платформе магнитного, поля.
Большинство современных приборов этого вида имеет следующие характеристики: частота возвратно-поступательных движений платформы 10 — 300 колебаний в 1 мин, частота вращательных движений платформы 40 — 400 об/мин, радиус вращения 20 - 25 мм, ход возвратно-поступательного движения 10—40 мм, стабильность поддержания, заданных параметров не менее ±1 % от заданной величины. Большинство моделей встряхивателей позволяет осуществлять перемешивание в одном режиме - вращательном или возвратно-поступательном. Наиболее современные модели являются универсальными, т.е. могут работать в любом из приведенных режимов перемешивания.
Микроскопы
Для оперативного получения качественной информации о состоянии культивируемых клеток используют специальные инвертированные микроскопы. Принцип инвертированности (перевернутости) заключается в том, что объект наблюдения освещается сверху, а наблюдение ведется через объективы, расположенные под объектом. Это позволяет наблюдать за живыми клетками в культуре, т.е. непосредственно в, сосудах, где происходит процесс их роста. В микроскопах с обычной оптической схемой исключается возможность помещения таких сосудов между столиком, и объективом из-за недостаточности этого расстояния.
Происхождение и характеристики клеток
Перечень типов клеток, которые в настоящее время можно культивировать, достаточно велик. Это элементы соединительной ткани (фибробласты), скелетные ткани (кость, и хрящи), скелетные, сердечная и гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, молочная железа, кожи, мочевой пузырь, почки), клетки нервной системы (глиальные клетки и нейроны, хотя последние лишены способности к пролиферации), эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и различные типы опухолевых клеток.
Для того чтобы клетки пролиферировали, они должны происходить скорее от недифференцированных клеток-предшественников, чем от полностью дифференцированных клеток, способность которых к пролиферации в норме утрачивается.
Однако популяция необязательно должна быть гомогенной и обладать фиксированным фенотипом. Некоторые культуры, например кератиноциты эпидермиса, содержат стволовые клетки, клетки-предшественники и кератинизированные чешуйчатые клетки. В такой культуре происходят постоянное обновление за счет стволовых клеток, пролиферация и созревание клеток-предшественников, терминальная необратимая дифференцировка, сопровождающаяся «слущиванием» чешуйчатых клеток в культуральную среду. Культуры других клеток; например фибробластов, представляют собой относительно однородную популяцию пролиферирующих клеток при низкой плотности монослой (около 104 клеток на 1 см2) и стиль же однородную популяцию более дифференцированных, непролиферирующих клеток при высокой плотности монослоя (105 клеток на 1 см2). Эта популяция фиброцитоподобных клеток при высокой плотности монослоя способна к возвращению в клеточный цикл в результате трипсинизации, снижающей плотность клеток в монослое, или соскабливания части клеток, приводящего к появлению свободного края монослоя. Дифференцировка и пролиферация клеток регулируются не только плотностью монослоя, но и питательными факторами среды (сыворотка, Ca2+), гормонами, взаимодействием с внеклеточным матриксом.
Дифференцировка
Ведение клеточных линий требует постоянного увеличения количества клеток, поэтому выбор условий культивировании направлен на обеспечение максимальной скорости клеточной пролиферации. Эти условия, как правило, неблагоприятны для дифференцировки клеток, при которой их рост существенно ограничивается или полностью подавляется. К условиям, способствующим размножению клеток, относятся их низкая плотность, невысокая концентрация Ca2+, присутствие ростовых факторов, таких как фактор роста эпидермиса, фактор роста фибробластов и фактор роста, синтезируемый тромбоцитами. Высокая плотность клеток (выше 105 клеток на 1 см2) и концентрация Ca2+ (300—1500 мкмоль); присутствие индукторов дифференцировки (гормоны, например гидрокортизон, фактор созревания глии, фактор роста нервов, ретиноиды; и полярные растворители, в частности диметилсульфоксид) способствуют прекращению клеточного деления и индуцируют дифференциpoвку клеток. Низкие концентрации сыворотки способствуют дифференцировке олигодендроцитов, но для дифференцировки бронхиального эпителия в ороговевающий используют высокие концентрации сыворотки. Большое значение, особенно для эпителия, имеет установление правильной полярности клеток и их формы. Клетки, растущие на взвеси коллагенового геля, смываются питательной средой со всех сторон, и это позволяет устанавливать правильную полярность относительно базальной мембраны, а также поддерживать правильную форму клеток благодаря субстрату.
Органная культура клеток
Исходно тканевыми культурами называли эксплантаты целых фрагментов тканей, полагая, что в этих фрагментах, по крайней мере частично, поддерживается гистологическая целостность. В настоящее время «культура ткани» превратилась д общее понятие, включающее в себя как органную культуру, в которой небольшие фрагменты ткани или целые эмбриональные органы эксплантируются с сохранением тканевой архитектоники, так и культуру клеток, в которой ткани диспергируются механически, ферментативно или путем спонтанной миграции клеток из эксплантации, и клетки размножаются в виде суспензии или монослоя, прикрепившегося к субстрату клеток.
При выборе того или иного типа культуры следует принимать во внимание следующее. Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода времени поддерживает гистологическую и биохимическую дифференцировку и после начальной травмы эксплантации и ряда центральных некрозов остается, как правило, в нерастущем равновесном состоянии в течение нескольких дней и даже недель. Культуры клеток, наоборот, как правило, лишены структурной организации, теряют характерную гистиотидическую. архитектонику и связанные с ней биохимические признаки и обычно не достигают равновесного состояния, в отсутствие определенных условий. Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток и их разделение на идентичные параллели. Культивируемые клетки могут, быть охарактеризованы, и определенная клеточная популяция может быть сохранена путем замораживания. Клетки идентифицируют по фенотипическим признакам, путем выращивания в селективной среде, физического отбора, клонирования или генотипически для получения относительно однородной линии клеток.
Источник ткани
Культуры, полученные из эмбриональных тканей, как правило, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с культурами из соответствующих «взрослых» тканей. ЭТР отражает, по-видимому, более низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток-предшественников или стволовых клеток в эмбрионах. «Взрослые» ткани, как правило, характеризуются пониженным пролиферативным пулом и более высоким содержанием неделящихся специализированных клеток, часто ассоциированных с более структурированным и слабо дезагрегирующим внеклеточным матриксом. Получение первичных культур клеток «взрослых» тканей и их размножение являются более сложной задачей, и продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика.
В качестве примеров широко используемых линий эмбриональных клеток можно привести различные линии ЗТЗ (мышиные эмбриональные фибробласты), линию MRC-5 и Другие линии эмбриональных легочных фибробластов человека. Клетки мезодермального происхождения (фибробласты, клетки эндотелия, миобласты) легче культивировать, чем эпителиальные клетки, нейроны и клетки эндокринных тканей.
Нормальные клетки, как правило, дают начало культурам с ограниченной продолжительностью жизни, тогда как культуры клеток, полученных из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долго. Известно, однако, несколько линий неограниченно пролиферирующих клеток (клетки почки собаки, фибробласты ЗТЗ), которые не прививаются при введении животным, т.е. не являются опухолеродными. Нормальные клетки обычно растут как недифференцированные стволовые клетки или клетки-предшественники, и наступление дифференцировки в такой культуре часто сопровождается полным прекращением пролиферации клеток. Некоторые нормальные клетки, например фибробласты и клетки эндотелия, способны дифференцироваться, затем дедифференцироваться, возобновлять пролиферацию и вновь дифференцироваться. Другие, например клетки ороговевающего эпителия и многие кроветворные клетки, после инициации дифференцировки не способны к возобновлению пролиферации.
В культурах клеток, полученных из опухолей, возможна дифференцировка, по крайней мере частичная, при сохранении способности к пролиферации. Опухолевые ткани часто могут пассироваться на сингенных хозяевах, и это обеспечивает простое и дешевое получение большого количества клеток, хотя полученные популяции могут быть недостаточно гомогенны. В случае отсутствия природных хозяев опухоли можно пассировать на бестимусных мышах. Многие другие различия между нормальными и злокачественными клетками аналогичны различиям между ограниченными и постоянными линиями клеток; имеются данные о важности приобретения «бессмертия» в неопластической трансформации клеток (Land H., 1983).
Субкультивирование.
Свежевыделенные культуры носят название «первичные» до начала пассирования или субкультивирования. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются малым пролиферативным пулом, но в них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены, а также четко обнаруживается экспрессия ряда свойств, присущих данной ткани. Субкультивирование обеспечивает возможность продления существования культуры (в результате субкультивирования получают линии клеток), возможность клонирования, исследования и сохранения клеток, а также получения более однородных популяций. При этом во многих случаях субкультивирование приводит к потере, специализированных клеток и дифференцировочных признаков.
Основным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.
Выбор среды
Среду, к сожалению, часто выбирают чисто эмпирически. Это не столь важно для постоянных линий клеток, но при работе со специализированными клетками, с первичными культурами, при выращивании клеток в отсутствие сыворотки выбор среды может иметь принципиальное значение.
Использование более сложных сред в отсутствие сыворотки имеет два преимущества: такие среды могут быть селективными для определенного типа клеток, а отсутствие сыворотки облегчает выделение из среды требуемых продуктов клеточного метаболизма. Тем не менее культивирование в присутствии сыворотки проще и, как ни странно, часто оказывается не более дорогим, хотя, конечно, труднее контролируется. Две основные причины все еще ограничивают применение бессывороточных сред:
1) очень медленно увеличивается выпуск коммерческих ингредиентов таких сред (не многие исследователи способны изготовлять среды собственными силами),
2) потребности в бессывороточной среде в большей степени зависят от типа используемых клеток.
Сыворотка нивелирует многие недостатки среды, которые могут проявляться в ее отсутствие. Проблема может стать особенно острой при культивировании опухолевых клеток; для клеточных линий, происходящих из разных опухолей, может требоваться модификация культуральной среды.
Газовая фаза
Состав газовой фазы определяется тремя факторами:
1) типом среды;
2) использованием открытых (чашки Петри, многолуночные чашки) или закупоренных (флаконы, бутылки) культуральных сосудов;
3) требуемой буферной емкостью.
Некоторые параметры культивирования могут варьировать, но необходимо соблюдать одно главное правило — концентрация гидрокарбоната и парциальное давление углекислого газа должны находиться в равновесии.
Субстрат
Природа субстрата зависит в основном от типа используемых клеток и характера проводимых исследований. Почти повсеместное распространение получил полистирол, обработанный таким образом, чтобы увеличить смачиваемость и придать поверхности отрицательный заряд. В особых случаях (культуры нейронов, мышечных клеток и некоторые культуры эпителиальных клеток) пластиковую поверхность покрывают желатином, коллагеном или полилизином для придания ей положительного заряда. Может быть использована и стеклянная посуда, но она должна быть тщательно вымыта с применением нетоксичных детергентов. Культуральные сосуды различаются по размеру — от многолуночных пластинок Тераски (площадь поверхности — 1 мм2, объем среды 5—10 мкл) и микротитровальных пластинок (примерно 30 мм3/100-200 мкл) до набора чашек и флаконов с площадью поверхности до 180 см2 и вращающихся бутылей. Определяющими факторами при выборе культуральной посуды являются требуемое количество клеток (максимальная плотность большинства трансформированных культур 5*104 - 5*105 клеток/см2). Чашки с 24 лунками удобны при большом количестве параллелей и одновременном отборе образцов, но в тех случаях, когда отбор образцов проводят в разное время, предпочтительнее использовать индивидуальные флаконы или бутыли. Чашки Петри дешевле флаконов и достаточно удобны для исследующей обработки клеток, например окрашивания или экстракции. Флаконы могут быть герметично закрыты, при этом не требуется инкубатор с продувкой углекислым газом, кроме того, при использовании флаконов снижается опасность заражения культур. В случае суспензионных культур определяющим фактором является объем сосуда. При увеличении объема может быть затруднено перемешивание и ухудшиться аэрация культур.
Подготовка
Во многих лабораториях для культур тканей используют пластмассовую посуду одноразового применения. Эти сосуды оптически прозрачны и подготовлены для использования при культивировании тканей путем модификации пластика, увеличивающей его смачиваемость и облегчающей прикрепление клеток. Некоторые культуральные сосуды выпускают уже стерилизованными. В целом пластмассовую посуду удобно применять и в процессе выращивания клеток, и для решения экспериментальных задач, однако одноразовая культуральная посуда дорогая.
Мытье стеклянной культуральной посуды
Для пассирования постоянных и многих ограниченных, линий клеток подходит стеклянная культуральная посуда, если есть условия для мытья посуды и возможность контроля его качества. Посуду нужно выдержать в растворе нетоксичного детергента, предпочтительно в течение ночи и после этого тщательно промыть проточной, а затем деионизованной или дистиллированной водой.
Стерилизация стеклянной посуды
Пластиковая посуда поступает стерильной, а стеклянную культуральную посуду перед использованием необходимо простерилизовать. Во многих лабораториях проводят массовую стерилизацию всей посуды независимо от ее непосредственного использования для культивирования, что позволяет избежать ошибок при выборе посуды. Стерилизацию лучше проводить в сухожаровом стерилизаторе (1600С в течение 1 ч), помещая посуду в контейнеры или заворачивая в фольгу. Завинчивающиеся крышки сосудов стерилизуют отдельно. Качество посуды, процесс её мытья и выбор детергента следует периодически контролировать. Для этого промывают посуду обычным образом, оценивают чистоту визуально, высушивают, стерилизуют и используют для клонирования клеток в монослое, предпочтительно при низкой концентрации сыворотки (2 — 5 %) или в ее отсутствие.
Первичная культура
Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не всё клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro. При пролиферации культивируемых клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками, поэтому может оказаться необходимым отбор специфических типов клеток путем клонирования, селективного культивирования или физического разделения клеток.
На первом этапе получения первичной культуры удаляют фрагмент ткани животного в стерильных условиях и подвергают его механической или ферментативной дезагрегации. Ткань может быть просто измельчена до кусочков объемом около 1 мм3, которые прикрепляются к поверхности чашки благодаря собственной адгезивности, наличию насечек на чашке или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях происходит рост клеток из фрагментов и клетки, мигрирующие из эксплантатов, могут быть использованы для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты можно переносить в новые чашки) и мигрирующие клетки можно удалить путем трипсинизации, а, остающийся эксплантат образует новые выросты. Трипсинизированные клетки пересевают в новые сосуды, и они становятся вторичной культурой. По формальным признакам такую культуру называют «линией клеток».
Первичные культуры могут быть также получены путем дезагрегации тканей ферментами, например трипсином (0,25% неочищенный или 0,01-0,05 % очищенный) или коллагеназой (200-2000 ЕД/мл, неочищенная). Клетки образующейся при этом суспензии оседают, прикрепляются к поверхности стекла или пластика и распластываются на ней. Такой способ получения культуры обеспечивает более высокий выход клеток, хотя он кажется более селективном поскольку только определенные клетки переживают диссоциацию. На практике успешное получение первичных культур из многих тканей, особенно из эпителия, связано с использованием коллагеназы, при этом размер эксплантата уменьшается до небольшого кластера клеток, который затем прикрепляется к субстрату и разрастается.
Субкультивирование
Монослойная культура может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения. В случае субкультивирования суспензионных культур достаточно разведения. Диссоциация клеток монослойной культуры лучше всего достигается путем промывания монослоя фосфатным солевым .буфером (ФСБ) или ФСБ с 1 мМ ЭДТА и последующей инкубации с холодным раствором трипсина (0,25 % неочищенный или 0,01—0,05 % очищенный) в течение 30 с. После этого трипсин удаляют, Клетки дополнительно инкубируют в течение 15 мин. Затем клетки суспензируют в среде, определяют их количество и рассевают в новые флаконы.
Кривая роста
После посева клеток во флакон они входят в лаг-период продолжительностью 2—24 ч, сменяющийся периодом экспоненциального роста (логарифмическая фаза). В конце этого периода клетки достигают плотного монослоя и входят в период медленного роста или покоя (фаза плато). Эти фазы характерны для всех клеточных линий и позволяют получить воспроизводимые характеристики клеточных линии: продолжительность лаг-периода, время удвоения популяции в середине логарифмической фазы и насыщающую плотность клеток в монослое в фазе плато. Воспроизводимость этих характеристик возможна только при постоянстве условий культивирования.
Определение параметров ростового цикла важно для пассирования культуры и проведения экспериментов на культурах. Поведение и биохимические свойства клеток заметно различаются в разные фазы роста культуры, так что важно контролировать стадию ростового цикла, в которой в культуру добавляют различные препараты либо реагенты или проводить сбор клеток для пересева. Форма кривой роста позволяет также получить информацию о репродуктивной потенциале культуры. Не вызывает сомнения тот факт, что клональный анализ прост и позволяет сделать более однозначные и правильные вывода.
Заражение культуры клеток
Опасность микробного заражения культур в значительной мере снижается благодаря использованию антибиотиков и ламинарных боксов. Однако следует по мере возможности избегать культивирования клеток с антибиотиками, поскольку проблема хронического латентного заражения все еще остается острой.
Следует как можно чаще проводить визуальную) оценку микробного заражения культуры по быстрому изменению рН. Как правило, заражение сопровождается снижением рН, хотя некоторые грибы могут индуцировать увеличение рН. Заражение может привести также к помутнению среды, появлению межклеточного грануляционного материала, обнаруживаемого при микроскопическом исследовании, и взвешенного в среде неидентифицированного материала. Во всех этих случаях культуральные сосуды изолируют, не вынимая пробки, и автоклавируют.
Источником заражения микоплазмой при культивировании клеток могут быть культуральная среда, сыворотка, трипсин или сам исследователь. Заражение не выявляется визуально, и, поскольку оно не приводит к изменению роста культуры, заражение микоплазмой часто остаётся незамеченным. Следует регулярно (один раз в 1 — 3 мес.) проверять культуры на наличие в них микоплазм, поскольку такое заражение значительно изменяет биохимию клеток, их антигенные свойства и параметры роста культуры. Предложено несколько методов выявления микоплазм, но наибольшее распространение получил метод флюоресцентного окрашивания ДНК по методу Чена.
Получение и культивирование эпидермоцитов
1. Полученный дерматомный срез помещают в пробирку, содержащую среду Игла + пенициллин (25.000 ЕД/мл) + стрептомицин (25.000 ЕД/мл) + фунгизон (50 ЕД/мл),— до 24 ч при комнатной температуре.
2. Отмывают в среде Игла до тех пор, пока среда не станет прозрачной.
3. Помещают ЭДТА на 20 мин при комнатной температуре.
4. Переносят в трипсин (0,05 % или 0,25 %) на 18 ч при +4 °С.
5. Фермент сливают и добавляют сыворотку для нейтрализации фермента.
6. Выделяют эпидермоциты в чашке Петри в сыворотке.
7. Центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин.
8. Осадок ресуспендируют в среде Игла (без Ca2+).
9. Суспензию клеток вносят в пластмассовые, покрытые коллагеном или гидрофильные чашки (из расчета не менее 70 000 - 100 000 на 1 см2).
10. Сменяют среду 2 раза в неделю до формирования монослоя.
Получение и культивирование фибробластов
1. Дерму после удаления эпидермиса измельчают ножницами в пенициллиновый флакон.
2. К гомогенату добавляют раствор коллагеназы (готовят на сред, активность коллагеназы от 0,28 до 630 ЕД/мл) и инкубируют в нем.
3. Фермент нейтрализуют путем добавления среды с 10 % сыворотки.
4. Центрифугируют при 1000 об /мин 5 мин.
5. Осадок ресуспендируют в среде (Игла и др. с обычными добавками).
6. Подсчитывают клетки в камере Горяева (20.000 клеток на 1см2).
7. Суспензию клеток переносят в культуральные чашки.
8. Сменяют среду на следующий день.
9. Проводят дальнейшее культивирование до формирования монослоя.
Выделение коллагена и покрытие им поверхности клеток для ускорения роста
Коллаген I типа может быть получен с помощью метода, предложенного S. Strom и соавт. (1982), из сухожилий, связанных с позвонками хвоста крыс.
1. Разрезают свежевыделенные или замороженные и оттаявшие хвосты продольно от основания до конца.
2. Удаляют кожу и кровеносные сосуды.
3. Берут белые коллагеновые волокна и стерилизуют их с помощью ультрафиолетового излучения.
4. Помещают 1 г коллагеновых волокон (из 3 — 4 хвостов) в 300 мл 0,1 М уксусной кислоты и оставляют перемешиваться при 4 °С в течение 48 ч.
5. Фильтруют раствор через 2 — 3 слоя стерильной марли.
6. Разводят полученный раствор в 20 раз бидистиллированной водой.
7. Покрывают раствором дно пластиковой чашки и высушивают на воздухе (1 — 2 дня при температуре, не превышающей 37 °С). Чашки можно хранить во влажной атмосфере при 4 °С в течение нескольких месяцев.
Исходный маточный раствор коллагена может быть также нейтрализован и разведен культуральной средой. В этом случае коллаген образует гель благодаря повышению рН и концентрации солей. Денатурированный (высушенный на воздухе) коллаген облегчает прикрепление клеток (например, клеток эндотелия и скелетных мышц), а нативный (неденатурированный) коллаген может оказаться необходимым для правильной фенотипической экспрессии.
Обработка поверхности клеток фибронектином для ускорения их роста
Фибронектин может быть получен с помощью метода, предложенного В. Obrink (1982), из свежей плазмы человека, не обработанной гепарином, в условиях подавления протеолитической активности фенилметилсульфонилфторидом. Можно использовать также коммерческие препараты фибронектина. Фибронектин применяют в количестве 1 — 5 мкг на 1 см3 поверхности культуральной посуды.
1. Растворяют при осторожном помешивании 20 мкг лиофилизованного фибронектина в 1 мл бидистиллированной воды.
2. Покрывают полученным раствором дно чашки диаметром 35 мм и высушивают на воздухе при 40 °С.
3. Тщательно промывает чашки дистиллированной водой и вновь высушивают на воздухе. Готовые чашки можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
|
