Хромосомный состав, или кариотип, клеточной линии

Хромосомный состав, или кариотип, клеточной линии

Хромосомный состав, или кариотип, является одной из основных характеристик и наиболее точным критерием для идентификации клеточной линии и связи его с тем видом и полом животного, от которого они были получены. Примеры кариотипов мыши и человека можно найти на сайте www.pathology.washington.edu/galleries/Cytogallery/ , а крысиный на сайте http://ratmap.gen.gu.se/Idiogram.html . См. также кариотин человека в Mitelman [1995] и других млекопитающих — Hsu and Benirschke [1967], хотя последний был опубликован прежде, чем была обнаружена исчерченность хромосом.

Хромосомный анализ может также позволять различать нормальные и трансформированные клетки, поскольку количество хромосом наиболее стабильно в нормальных клетках (кроме мышей, где хромосомный набор нормальных клеток при культивировании может достаточно быстро меняться).

Варианты

Блокирование клеток в метафазе.

1) Можно использовать винбластин, 1х10-6М вместо колцемида.

2)Продолжительность блокирования клеток в метафазе может быть увеличена для того, чтобы увеличить количество метафазных пластинок на препарате для подсчета хромосом, или укорочена для снижения конденсации хромосом и улучшения распознавания исчерченности.

Сбор митотических клеток.

Метафазные клетки некоторых культур, например СНО или HeLa, легко отделяются от субстрата при встряхивании (метод «встряхивания»), не требуя трипсинизации. Процедура проводится следующим образом: 1)добавить колцемид, 2) осторожно удалить колцемид и заменить его гипотоническим раствором цитрат/КСI, 3) встряхнуть флакон для того, чтобы отделить от подложки метафазные клетки до или после инкубации в гипотонической среде, и 4) фиксировать клетки, как описано выше.

Гипотоническая обработка.

Заменить только 0,075 М КС1 или вместе с 50% раствором HBSS в дистиллированной воде на гипотонический цитрат, использованный в протоколе. Продолжительность гипотонической обработки может варьировать от 5 до 30 мин для снижения лизиса или улучшения распластывания клеток.

Распластывание клеток по стеклу. Возможно, на этой стадии существует больше возможностей для вариаций, чем на какой-то еще. Эти вариации призваны обеспечить большую степень и площадь распластывания клеток на препарате. Эти вариации включают:

1)изменение высоты падения капли на стекло (закрепите пипетку в штативе и отметьте положение стекла, проведя пробную серию испытаний с определением оптимального);

2) высушивание в пламени (высушите стекло после падения капли прогреванием над пламенем или выжиганием фиксирующей жидкости пламенем сразу после распределения капли по стеклу; однако последний может затруднить последующую идентификацию исчерченности);

3) глубокое охлаждение стекла (поместите стекло на твердый СO2 до распластывания клеток);

4) охлаждение осажденной клеточной суспензии в холодильнике в течение ночи до того, как капнуть на стекло;

5) капать на охлажденное стекло (например, погрузить стекло в холодный этанол и высушить перед применением) и затем поместить стекло над стаканом кипящей воды;

6) наклонить стекло или сдуть каплю по стеклу в то время, как капля растекается

Дифференциальное окрашивание хромосом

Эта группа методов (см. [see Rooney & Czepulkowski, 1986] была разработана для того, чтобы облегчить идентификацию отдельных пар хромосом при небольших морфологических различиях между парами [Wang & Fedoroff, 1972,1973]. Для окрашивания по Гимза белки хромосом частично расщепляются трипсином, что приводит к появлению исчерченности при дальнейшем окрашивании. При окрашивании хинокрином трипсинизация не требуется. Хромосомная исчерченность индивидуальна для каждой пары хромосом (рис. 16.7).

Существуют следующие методы выявления хромосомной исчерченности 1) метод Гимза (использование только трипсина или, чаще, совместное применение трипсина и EDTA); 2) Q-окрашивание [Caspersson et al., 1968] (окрашивание клеток 5%-м (v/v) раствором дигидрохлорида хинокрина в 45%-й уксусной кислоты, промывание препарата и заключение препарата в деионизованной воде при pH 4.5) [Lin & Uchida,1973; Uchida & Lin, 1974]; 3) С-окрашивание (этот метод позволяет выделить районы центромеров, фиксированные препараты предварительно обрабатываются в течение 15 мин 0,2 М НСI и 2 мин 0,07 М NAOH и затем обрабатываются в течение ночи SSC (либо 0,03 М цитрата

натрия, 0,3 М NaCl или 0,09 М цитрат натрия, 0,9 М NaCl) до окрашивания красителем Гимза [Arrighi &Hsu, 1974].

Методы, которые были разработаны для идентификации хромосом мыши и человека, преимущественно помогают при анализе гибридов мышиных и человеческих кариотипов. К этим методам относятся: флуоресцентное окрашивание красителем Hoechst 33258,

вызывающего более интенсивное свечение мышиных центромеров по сравнению с человеческими [Hilwig & Gropp, 1972; Lin et al., 1974], щелочное окрашивание красителем Гимза («Giemsa-11») [Bobrowet al., 1972; Friend et al., 1976] (см. рис. 16.7e) и гибридизация in situ с хромосомными красителями.

  Рис. 16.6. Приготовление препарата хромосом.

Приготовление препарата хромосом из монослойной культуры методом раскалывания

ПРОТОКОЛ. Приготовление хромосомного препарата

Схема

Зафиксировать клетки, блокированные в метафазе и набухшие в гипотонической среде. Капнуть клетки на стекло, окрасить и исследовать (рис. 16.6) [Rothfels и Siminovitch, 1958; Rooney и Czepulkowski, 1986].

Материалы

Стерильные или асептически подготовленные:

•          Культура клеток в log-фазе

•          Кольцемид, lxlO-5 М в D-PBSA

•          D-PBSA

•          Трипсин неочищенный, 0,25%

Нестерильные:

• Гипотонический раствор: 0,04 М. KCL, 0,025 М цитрат натрия

• Свежеприготовленный фиксатор (уксусный метанол): 1 часть ледяной уксусной кислоты плюс 3 части безводного метанола или этанола, хранить на льду

• Краситель Гимза

• DPX или Permount mountant

• Лед

• Центрифужные пробирки

• Пастеровские пипетки

• Стекла предметные

• Стекла покровные, # 00

• Чашка для стекол

• Низкоскоростная центрифуга

• Вортекс-миксер

Протокол

1. Внесите культуру во флакон 75-см2 при плотности 2х10*4-5х10*4 кл./мл (4х10*3и 1х10*4 кл./см2) в объеме 20 мл.

2. Приблизительно через 3-5 дня, когда клетки находятся в log-фазе роста, добавьте к среде 0,2 мл колцемида lxlO-5 М до конечной концентрации1х107М.

3. Через 4-6 ч осторожно удалите среду, добавьте 5 мл 0,25% трипсина и инкубируйте культуру 10 мин.

4. Центрифугируйте клетки в трипсине, удалите супернатант с трипсином.

5. Ресуспендируйте клетки в 5 мл гипотонического раствора и оставьте их в течение 20 мин при 37 °С.

6. Добавьте равный объем свежеприготовленного холодного уксусного метанола, постоянно перемешивая, затем отцентрифугируйте клетки при 100 g в течение 2 мин.

7. Удалите супернатант, разбейте осадок на вортекс-миксере, медленно добавляя свежий уксусный метанол при постоянном перемешивании.

8. Оставьте клетки в течение 10 мин на льду.

9. Центрифугируйте клетки в течение 2 мин при 100 g.

10. Удалите супернатант, содержащий уксусный метанол, и ресуспендируйте осадок на вортекс-миксере в 0,2 мл уксусного метанола, чтобы получить суспензию отдельных клеток.

11. Наберите одну каплю суспензии в кончик пастеровской пипетки и капните примерно с высоты 30 см на холодное предметное стекло. Наклоните стекло и позвольте капле стечь по стеклу.

12. Быстро высушите стекло над сосудом с кипящей водой, исследуйте в фазово-контрастном микроскопе. Если клетки равномерно распределены и не касаются друг друга, приготовьте большее количество стекол, используя ту же самую концентрацию клеток. Если клеток слишком много и они перекрывают друг друга, то надо развести суспензию в 2 раза и в 4 раза и вновь сделать препарат капли. Если клетки при разведении

находятся в удовлетворительной концентрации, тприготовьте большее количество стекол. Если нет, то разведите суспензию далее и повторите этот шаг.

13.Окрасьте клетки красителем Гимза:

а)         Разместите стекла в кювету для окрашивания, помещенную над раковиной.

б)         Полностью покройте клетки несколькими каплями профильтрованного красителя Гимза на 2 мин.

в)         Залейте стекла приблизительно 10-кратным объемом воды.

г)         Оставьте стекла для дальнейшей окраски еще на 2 мин.

д)         Отмойте краситель проточной водой.

Примечание. Не сливать краситель со стекол, поскольку это оставит на стенке пену окислившейся краски; всегда смывать краситель водой. Даже когда окрашивание проводится в чашке, краситель никогда не сливают, он должен быть смыт струей воды.

е)         Закончите окраску, промывая каждое стекло проточной водой, чтобы удалить любой осадок красителя.

ж)        Проверьте окраску под микроскопом. Если качество удовлетворительно, полностью высушите стекло, закройте покровным стеклом #* 00 при помощи клея DPX или Permount.

Рис. 16.7. Окрашивание хромосом,

(a) Выявление дисков  в хромосомах человека по стандартному методу окраски по Гимза.

(b) Тот же препарат, что и в  (c), но окрашенный по Hoechst 33258.

(в) Гибрид человеческой и мышиной клеток, окрашенный по Гимза при pH 11.

Хромосомы человека менее интенсивно окрашены, чем мышиные хромосомы.

Некоторые хромосомы претерпели транслокацию, образовав человеческо-мышиный гибрид. (С любезнеого разрешения R.L. Church.)