Выявление нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты (высокомолекулярные соединения сложного химического состава) играют чрезвычайно важную роль в обеспечении жизнедеятельности любой животной и растительной клетки. Рибонуклеиновая кислота (РНК) осуществляет синтез белков, а дезоксирибонуклеиновая (ДНК) — хранение и передачу наследственных признаков. Первая содержится в цитоплазме и ядрышках, вторая — в хроматине ядер. Столь важная роль нуклеиновых кислот является причиной большого интереса к изучению их содержания и распространения в органах и тканях организма. Существует несколько способов гистохимического выявления нуклеиновых кислот, но наибольшее распространение получил метод Браше (для выявления РНК) и метод Фельгена (для выявления ДНК).
Выявление РНК по методу Браше
(фиксаторы могут быть различные, но наилучшие Карнуа,
Бродского и Ценкера; заливка в парафин)
В настоящее время этот метод во многом утратил свое былое важное значение в связи с тем, что результат реакции не поддается количественной оценке на цитоспектрофотомётре. Вместе с тем данный метод еще довольно широко применяется в лабораториях (особенно, где нет цитоспектрофотометров) и само его освоение дает навык лаборанту в приготовлении и очистке химических растворов.
Сущность метода заключается в избирательном присоединении некоторых основных красителей к нуклеиновым кислотам (при настоящем методе — пиронина к РНК и метилового зеленого к ДНК).
Прежде чем приступить к гистохимической реакции, необходимо произвести очистку метилового зеленого, так как имеющийся в продаже препарат всегда содержит примесь метилового фиолетового, значительно искажающего результат окраски. Для этого к водному раствору метилового зеленого добавляют хлороформ (или амиловый спирт) и, закрыв сосуд, энергично встряхивают. После того как смесь отстоится, в ней отчетливо видны два слоя — темный верхний, представляющий водный раствор красителя, и нижний фиолетовый — хлороформ, окрашенный метиловым фиолетовым. Слив осторожно водный раствор, к нему вновь добавляют хлороформ и повторяют всю процедуру. Отмывание производят до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться в фиолетовый цвет. Очищенный и высушенный препарат может храниться длительное время.
Рабочие растворы
Раствор А: 5% водного раствора пиронина 17,5 мл, 2% водного раствора метилового зеленого 10 мл, воды дистиллированной 250 мл.
Раствор Б: 0,5М ацетатный буфер с рН 4,8.
Перед употреблением сливают равные объемы растворов А и Б (хранить не более недели).
Метод.
1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
2. Поместить в раствор метилового зеленого — пиронина (от 100 мин до 20 ч).
3. Промыть в течение нескольких секунд в дистиллированной воде (увеличение сроков промывки приводит к вымыванию пиронина).
4. Высушить фильтровальной бумагой.
5. Быстро провести через абсолютный ацетон, смесь из равных частей ацетона и ксилола, 10% раствор ацетона в ксилоле.
6. Просветлить в двух порциях ксилола и заключить в бальзам.
Результат. РНК ядрышек и цитоплазмы ярко-красного цвета, хроматин ядер зеленый или сине-зеленый.
В целях проверки специфичности окрашивания на РНК ставят параллельно контрольную гистохимическую реакцию. Для этого путем специальной обработки из срезов удаляют РНК, после чего производят окрашивание метиловым зеленым — пиронином по описанной выше схеме.
Результат. Окраска пиронином не происходит, метиловым зеленым — ослаблена.
Наилучшим способом удаления РНК является обработка срезов ферментом рибонуклеазой (0,1—0,5 мг кристаллической рибонуклеазы в 1 мл дистиллированной воды) в течение 2—3 ч при 56°С.
Приотсутствии рибонуклеазы можно произвести экстракцию РНК, помещая срезы в 10 % раствор холодной хлорной кислоты (HCIO4) на 3-4 ч.
Выявление ДНК по методу Фельгена
(фиксаторф различные, но лучше Карнуа, Ценкера; заливка в парафин)
Сущность метода заключается в том, что продукты расщепления молекулы ДНК, осуществляемого в слабокислой среде, взаимодействия с бесцветной фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа ), образует комплекс, обладающий пурпурной окраской. Таким образом, локализация продукта гистохимической реакции указывает местонахождение ДНК, а интенсивность окраски- ее концентрацию.
Приготовление растворов
Реактив Шиффа.
Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды и, периодически встряхивая сосуд с раствором, продолжают кипячение в течение 5 мин. Затем охладив содержимое до 50°С, раствор фильтруют, добавляют 20 мл 1N раствора НСI и охлаждают до 25°С, после чего добавляют 1 г метабисульфита натрия (Na2S2O5 ) или калия (K2S2O5) и оставляют в темноте. Через 18—24 ч в раствор всыпают 2г активированного угля, встряхивают в течение 1 мин, отфильтровывают и хранят в темноте при 0—4°С. Готовый реактив Шиффа бесцветен или имеет светло-желтую окраску. Покраснение раствора в процессе хранения свидетельствует о его разложении и непригодности к употреблению.
Необходимо иметь в виду, что иногда в продажу поступает недостаточно очищенный основной фуксин. Поэтому если приготовленный раствор не отвечает предъявляемым требованиям, нужно взять основной фуксин из новой партии и вновь приготовить реактив.
Однонормальный раствор хлористоводородной кислоты (1N).
К 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,19) добавляют 90 мл дистиллированной воды. Раствор может храниться длительное время.
Сернистокислая вода для промывки срезов.
К 5 мл 10% бисульфита калия (K2S2O5 ) добавляют 5 мл 1N раствора НСI и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Раствор бисульфита калия можно применять в течение 7 дней, сернистокислую же воду готовят перед употреблением и применяют однократно.
Метод.
1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
2. Быстро ополоснуть в холодной 1N HC1.
3. Поместить в 1N HC1 при 60°С на 6мин (стаканчик ставят в водяную баню).
4. Быстро ополоснуть в холодной 1N HC1, а затем в дистиллированной воде.
5. Поместить в реактив Шиффа на 40—60 мин.
6. Осушить фильтровальной бумагой и ополоснуть в трех порциях свежеприготовленной сернистокислой воды по 1—2 мин в каждой.
7. Промыть в водопроводной воде до 10 мин (если нужно докрасить цитоплазму: срез помещают на 1—1,30мин в 1% водный раствор светлого зеленого или 0,5% спиртовой раствор прочного зеленого).
8. Обезводить, просветлить и заключить в бальзам.
Результат.
Участки ядер, содержащие ДНК, окрашиваются в красновато-пурпурный цвет(цитоплазма светло-зеленая).
| 
