Гистохимия ферментов
Общие замечания
Ферменты — белковые вещества, выполняющие роль биологических катализаторов. Чрезвычайно важны для обеспечения обменных процессов в живых организмах. Они играют основную роль в обеспечении и регулировке биохимических реакций в живых структурах, в силу чего наиболее ранние этапы нарушения обмена, ведущие в дальнейшем к морфологическим изменениям микроструктур, обнаруживаемых обычными гистологическими методами, происходят преимущественно в сфере деятельности ферментов. Поэтому естественно то большое внимание, которое уделяют исследователи изучению состояния отдельных ферментов и ферментных систем при нормальных и патологических процессах в организме.
Ферменты обладают строгой специфичностью к веществам, на которые они воздействуют (субстрат), и проявляют активность при определенных условиях температуры и реакции (рН) среды (нейтральная, кислая, щелочная).
Гистохимическое исследование ферментов имеет свои специфические особенности:
а) в ходе гистохимической реакции выявляется не сам фермент, а продукт, образующийся в результате взаимодействия фермента с субстратом (веществом, на которое воздействует данный фермент);
б) для определения истинной локализации фермента в микроструктурах необходимо, чтобы продукт его деятельности был тут же осажден в виде нерастворимого соединения, иначе в результате диффузии будет получена ложная локализация. В тех случаях, когда осадок бесцветный, его необходимо превратить в окрашенный продукт, видимый в микроскоп. Схематично всю реакцию можно представить в следующем виде:
Фермент в клетке+субстрат>неокрашенный продукт реакции
Осадитель+ проявитель>
>окрашенный нерастворимый продукт реакции
Например:
Щелочная фосфатаза в тканях среза + alfa-глицерофосфат +
(фермент) (субстрат)
+ биологические активаторы (например,MgCl2)> Освобожденный фосфат + СаС12 (осадитель)>
>Са3(РО4)2+Со(NО3)2>нерастворимый, неокрашенный продукт
>Со3(РО4)2+(NH4)2S>
неокрашенный желтый сульфамид аммония
>CoS (окрашенный нерастворимый продукт реакции)
В конечном итоге мы получаем характеристику активности исследуемого фермента. Чем большее количество продукта образуется в результате взаимодействия фермента и субстрата, тем менее окраска структур и, следовательно, выше активность фермента. Наоборот, чем слабее окраска, тем активность фермента ниже.
Из сказанного видно, сколь сложен процесс гистохимического определения активности ферментов. Это находит свое отражение и в методических приемах, принципы которых необходимо знать и постоянно помнить в процессе работы.
Так, чувствительность ферментов к изменениям температуры и рН среды приводит к значительной потере их активности при подготовке тканей к заливке в парафин. Хотя в ряде руководств имеются рекомендации по выявлению некоторых ферментов в парафиновых срезах, эти методы не находят широкого применения, так как не являются надежными, особенно для органов и тканей, в которых активность исследуемых ферментов невысока. Наилучшие результаты могут быть достигнуты при изучении срезов- нефиксированной ткани, полученных в специальном приборе — криостате , а для ряда ферментов — и срезов, приготовленных с помощью обычного замораживающего микротома из тканей, предварительно фиксированных охлажденными фиксирующими жидкостями (формалин, ацетон). Существуют и более сложные способы подготовки блоков из нефиксированной ткани с применением специальной аппаратуры.
Специфические особенности и свойства ферментов предъявляют высокие требования к условиям проведения гистохимической реакции, в первую очередь к составлению среды для инкубации срезов. Обязательными ингредиентами последней являются субстрат (специфичный для данного фермента), буферный раствор (обеспечивающий определенную реакцию среды), вещества, препятствующие диффузии продукта реакции. По мере надобности в инкубационную среду вводят и другие компоненты, стимулирующие ход реакции (активирующие деятельность фермента, блокирующие отдельные звенья химических процессов и др.).
В настоящее время разработаны методы выявления довольно большого количества ферментов, перечислить которые в настоящем руководстве не представляется возможным. Остановимся лишь на некоторых, наиболее часто применяемых в гистологических лабораториях. К ним следует отнести методы выявления активности ряда гидролитических и окислительных ферментов.
Выявление гидролаз
Из группы гидролитических ферментов рассмотрим способы выявления щелочной и кислой фосфатаз и аденозинтрифосфатазы. Первые два фермента неспецифичны. Они катализируют реакции переноса фосфатных групп (трансфосфорилирование) с одних органических соединений на другие, а также участвуют в гидролизе эфиров фосфорной кислоты.
Аденозинтрифосфатаза осуществляет гидролиз аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), являющейся основным поставщиком энергии для обменных процессов в органах и тканях, в силу чего изучение активности этого фермента помогает получить представление об уровне энергетических процессов в исследуемых биологических объектах.
Принцип выявления фосфатаз сходен. Фермент, находящийся в исследуемой ткани, при соответствующих условиях (рН среды, температура) отщепляет ионы фосфата от находящегося в растворе субстрата (органическое фосфорсодержащее соединение, специфичное для данного фермента). Имеющиеся в растворе ионы металла (кальция или свинца) тут же связывают фосфат, образуя нерастворимый бесцветный осадок, который выпадает в месте локализации фермента. При обработке срезов сульфидом аммония fХ[(NH4)2S] осадок приобретает коричнево-черную окраску. Сульфид амония можно заменить сульфидом натрия (Na2S).
Выявление кислой фосфатазы по Гомори
Применяют замороженные срезы толщиной 10—15 мкм из нефиксированной, фиксированной в охлажденном растворе ацетона или 10% нейтрального формалина (4—24 ч при 0—4°С) ткани, наклеенные на предметные стекла или свободноплавающие.
Приготовление 0,05 М ацетатного буфера рН 5,0.
Исходные растворы:
А — растворить 1,36 г ацетата натрия (CH3COONa) в 200 мл дистиллированной воды;
Б — к 1,5 мл ледяной уксусной кислоты долить дистиллированной воды до 500 мл.
Растворы могут храниться длительное время. Для получения 50 мл ацетатного буфера рН 5,0 необходимо слить 15 мл "раствора А с 35 мл раствора Б.
Инкубационная среда.
Растворить 1 г ?-глицерофосфата натрия в 50 мл ацетатного буфера (0,05М с рН 5,0) и затем добавить 660 мг нитрата свинца [Pb(NO3)2]. Полученную мутную смесь отфильтровать.
Приготовление сульфида аммония. [(NH4)2S]. Пропускать сероводород (H2S ) через 200 мл концентрированного NH4ОН до прекращения поглощения газа. Затем прибавить еще 200 мл концентрированного NH4OH и разбавить водой до 1 л. Насыщение аммиачного раствора производят в вытяжном шкафу в хорошо проветриваемом помещении, так как оба вещества имеют сильный и неприятный запах. Сосуд с сульфидом аммония необходимо хорошо закрыть. Раствор хранится длительное время.
Сульфид аммония можно заменить 5—15% раствором сульфида натрия. Бесцветные кристаллы соли легко поглощают воду (Na2S,-9Н2О), поэтому в процессе хранения становятся влажными и несколько ослизненными. Для приготовления рабочего раствора берут нужное количество кристаллов соли, отмывают в проточной воде до появления неприятного сернистого запаха и растворяют в дистиллированной воде (5—15 г на 100 мл воды). Сосуд следует плотно закрыть.
Метод.
Поместить срезы в инкубационную среду и поставить в термостат при 37°С на время от 30 мин до 6 ч (в зависимости от исследуемых органов).
Ополоснуть в дистиллированной воде.
Обработать сульфидом аммония в течение 0.5 —1 мин (срез принимает темно-коричневую окраску).
Промыть в дистиллированной воде (если нужно, докрасить) и заключить в глицерин-желатин.
Результат.
Наличие черно-коричневого осадка сульфида свинца указывает на присутствие в тканях фермента.
Выявление щелочной фосфатазы по Гомори
(фиксация и приготовление срезов, как и для кислой фосфатазы)
Инкубационная среда.
К 10 мл 3% раствора 3-глицеро-фосфата натрия добавить 10 мл 2% раствора мединала натрия, 20 мл 2% раствора хлорида кальция (СаС12), 1 мл 5% раствора сульфата магния (MgSO4 ) и 5 мл дистиллированной воды. Если при сливании наблюдается помутнение, отфильтровать. Полученный раствор должен иметь рН 9,4. Сохраняется в холодильнике до нескольких недель.
Метод.
Поместить срезы в инкубационную среду и поставить в термостат при 37°С от 30мин до 4 ч.
Промыть в водопроводной воде и в течение 3—5 мин обработать в 2% растворе хлорида кобальта (СоС12).
Ополоснуть в дистиллированной воде и обработать с сульфидом аммония (до почернения среза).
Промыть в нескольких порциях дистиллированной воды (если нужно докрасить), обезводить, просветлить и заключить в бальзам.
Результат.
Черные отложения сульфида кобальта указывают локализацию ферментативной активности.
Приведенные методы длительное время считались наиболее предпочтительными. Однако в последние годы они вытесняются методами, основанными на применении азокрасителей (методом азосочетания), поскольку методы Гомори недостаточно специфичны, осадок грубый, искажающий реальную картину, особенно при выявлении щелочной фосфатазы.
Выявление щелочной фосфатазы по Берстону
[замороженные среды из свежего материала, фиксированные 5—10 мин в охлажденном (0—4°С) ацетоне или на протяжении 1—2 ч в холодном нейтральном 10% формалине; толщина 15 мкм]
Основной рабочий раствор:
в 0,25мл ацетона растворить 5 мг субстрата (нафтол-АS:ТR-фосфата); добавить 25 мл дистиллированной воды, 25 мл 0,2 М трис-буфера (рН 8,5) и 30 мг соли диазония (синий прочный ББ).
Профильтровать.
Метод.
1. Высушивание срезов, наклеенных на стекле с белком, на воздухе (10—15 мин).
2. Инкубация в основном рабочем растворе.
3. Промывка в дистиллированной воде (осторожно!).
4. Докрашивание разведенным гематоксилином.
5. Заключение в глицерин-желатин.
Результат: окраска структур синего цвета, интенсивность которого зависит от активности фермента.
Выявление АТФ-азы по методу Вахштейна — Мейзеля
(фиксация и приготовление срезов те же, что и при выявлении фосфатаз по Гомори)
Инкубационная среда.
Растворить 25 мг двунатриевой соли АТФ в 20 мл дистиллированной воды, добавить 20 мл 0,2М трис-буфера (рН 7,2), 1—3 мл 2% раствора нитрата свинца [Pb(NO3)2 3, 5 мл 0,1М раствора сульфата магния (MgSO4 ) и долить 2 мл дистиллированной воды. Если нужно, отфильтровать, довести рН до 7,2 (инкубационную среду готовить перед употреблением и добавлять ингредиенты в указанном порядке).
Метод:
1. Поместить приготовленные срезы в инкубационную среду на 10—60 мин при 37°С.
2. Тщательно промыть в нескольких порциях дистиллированной воды.
3. Обработать раствором желтого сульфида аммония в течение 1 мин (появляется темно-коричневая окраска среза).
4. Быстро ополоснуть в дистиллированной воде.
5. Заключить в глицерин-желатин или после обезвоживания в бальзам.
Результат.
Места АТФ-азной активности окрашены в коричнево-черный цвет.
Общее примечание к выявлению фосфатаз. Передержка в сульфиде аммония может привести к разрушению тканей среза. Если промывание после обработки сульфидом аммония вызывает сморщивание и отклеивание срезов, рекомендуем помещать их на 5—10 мин в 6% нейтральный раствор формалина и лишь затем, ополоснув в воде, заключить в соответствующую среду.
Выявление окислительно-восстановительных ферментов
Этот класс ферментов осуществляет важнейший этап обменных процессов в живых организмах — биологическое окисление различных веществ, образующихся в процессе обмена белков, жиров и углеводов.
В ходе биологического окисления происходят выработка и накопление энергетических ресурсов клетки, используемых ею для осуществления своих жизненных функций. Этот сложный многоступенчатый процесс совершается последовательно с помощью целой цепи, состоящей из ферментов и вспомогательных соединений. Суть его заключается в отщеплении от окисляемого субстрата атома водорода и переноса его электрона к кислороду. При этом атомарный кислород, поступающий в ткани из крови, активируется и, соединяясь с протоном водорода, образует молекулу воды. Столь важная роль окислительных ферментов в обеспечении обмена в органах и тканях определяет большой интерес к их изучению. Различают три основные группы окислительных ферментов:
1)дегидрогеназы, катализирующие первый этап окисления — отнятие водорода от субстрата и перенос на промежуточное соединение окислительной цепи;
2)оксидазы, катализирующие перенос электрона от промежуточного соединения к кислороду;
3) пероксидазы, обеспечивающие перенос электрона к перекисям. Наибольшее применение в гистохимии окислительных ферментов получили методы выявления дегидрогеназ. Они основаны на свойстве солей тетразолия легко восстанавливаться (присоединяя электрон водорода), переходя при этом из бесцветной растворенной в" воде соли в нерастворимые окрашенные в темно-синий цвет мельчайшие кристаллы формазана.
Необходимо знать, что если ткани содержат большое количество липидов, то они искажают ход гистохимической реакции за счет собственного окисления, в результате выпадают грубые, неправильной формы, темные, крупные кристаллы. В этих случаях следует предварительно, поместить срезы на 1—2 мин в охлажденный (—5°, —10°С) ацетон.
Выявление сукцинатдегидрогеназы по Нахласу
(срезы из свежезамороженной ткани, приготовленные в криостате и наклеенные на предметные стекла)
Приготовление исходных растворов.
А — 0,2 М раствор сукцината натрия (27 г соли растворить в 100 мл дистиллированной воды);
Б — 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,6) — 100 мл (приготовление см. с.265);
В — 30 мг нитросинего тетразолия (нитро СТ) растворить в 30 мл дистиллированной воды.
Инкубационная среда.
Слить равные количества растворов А и Б и добавить раствор В в количестве, равном сумме первых двух.
Метод.
1. Приготовленные в криостате и подсушенные на воздухе срезы инкубировать в термостате при 37°С 10—30 мин.
2. Ополоснуть в изотоническом растворе хлорида натрия.
3. Поместить на 10 мин в 10% раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе хлорида натрия.
4. Промыть в 15% этиловом спирте в течение 45 мин.
5. Обезводить в спиртах и заключить в бальзам.
Результат.
Темно-синий осадок локализуется в структурах, обладающих ферментативной активностью.
Подобным образом выявляется активность прочих дегидрогеназ, меняются только среда инкубации и способы заключения препаратов.
| 
