Буферные растворы и их приготовление
Химические процессы, протекающие в тканях организма, особенно с участием ферментов, требуют наличия ряда условий, среди которых важное значение имеет рН среды. Как известно, степень кислотности данного раствора зависит от концентрации ионов Н+ , а степень его щелочности — от концентрации ионов ОН-.
При определенной температуре произведение положительно и отрицательно заряженных ионов -величина постоянная. Зная один из показателей, можно определить другой. Исходя из этого положения, в химии принято обозначать кислотность или щелочность раствора условно через водородный показатель (рН), представляющий логарифм концентрации ионов Н+ , взятый с обратным знаком. Так, при рН 7,0 концентрация ионов Н+ равна концентрации ионов ОН- и раствор имеет нейтральную реакцию. Чем показатель рН меньше 7,0, тем концентрация ионов Н+ выше (ведь показатель с обратным знаком) и тем больше кислотность раствора. Наоборот, чем рН больше 7,0, тем меньше ионов Н+ в растворе и более выражены его щелочные свойства.
Различные ферменты требуют для проявления своей активности разные значения рН.
Так, оптимальное условие для действия щелочной фосфатазы при рН 9,0, тогда как для кислой фосфатазы требуется рН 5,0.
Чтобы обеспечить наилучшие условия для проявления активности гистохимически выявляемого фермента, необходимо, чтобы в среде инкубации поддерживалось значение рН, оптимальное для данного фермента. Это условие достигается введением в среду инкубации буферных смесей с заданными значениями рН. Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.
Приготовление буферных растворов
Прежде чем дать прописи буферных смесей, необходимо напомнить, что для определения концентрации растворов реактивов приняты понятия молярность (М) и нормальность (N).
Молярность раствора (М) — количество грамм-молей вещества, содержащихся в 1 л раствора. Грамм-моль — молекулярная масса данного вещества, выраженная в граммах. Например, для приготовления раствора в концентрации 0,2 М необходимо на 1 л раствора взять вещество в количестве, равном 0,2 его молекулярной массы.
Нормальность (N) — количество грамм-эквивалентов в 1 л раствора.
Грамм-экивалент — количество данного вещества, химически равноценное в данной реакции 1 грамм-атому водорода.
Для сложных веществ - это количество вещества, соответствующее прямо или косвенно при химических превращениях 1 грамму водорода или 8 граммам кислорода.
Поэтому:
Эоснования = Моснования / число замещаемых в реакции гидроксильных групп
Экислоты = Мкислоты / число замещаемых в реакции атомов водорода
Эсоли = Мсоли / произведение числа катионов на его заряд
Пример
| Э H2SO4 = М H2SO4 / 2 = 98 / 2 = 49 г
Э Ca(OH)2 = М Ca(OH)2 / 2 = 74 / 2 = 37 г
Э Al2(SO4)3 = М Al2(SO4)3 / (2· 3) = 342 / 2= 57 г
|
Фосфатный буфер (рН 6,0—8,0).
Растворы:
А — 0,2 М КН2 РО4 (13,6 г соли в 1 л дистиллированной воды);
Б — 0,2 М Na2 НР04 (31,2 г Na2 НРО4 . 2Н2 О в 1л дистиллированной воды).
Для получения 100 мл буфера нужного рН следует слить растворы Аи Б в количествах, указанных в табл. 1.
Таблица 1
| pH
| 6,0
| 6,5
| 7,0
| 7,2
| 7,4
| 7,6
| 8,0
| Раствор, мл
| А Раствор, мл
| 87,9
| 68,7
| 48,8
| 27,4
| 18,2
| 11,5
| 3,1
| Б Раствор, мл
| 12,1
| 31,3
| 51,2
| 72,6
| 81,8
| 88,5
| 96,9
|
Ацетатный буфер (рН 3,6—5,6).
Растворы:
А — 0,5N СН3 СООН (30 мл ледяной уксусной кислоты долить к 970 мл дистиллированной воды);
Б — O,5N CH3 COONa (68 г соли растворить в 1 л дистиллированной воды).
Слить растворы А и Б в количествах, указанных в табл. 2.
Таблица 2
| рH
| 3,6
| 3,8
| 4,0
| 4,2
| 4,4
| 4,6
| 4,8
| 5,0
| 5,2
| 5,4
| 5,6
| Раствор, мл
| А
| 185
| 176
| 164
| 147
| 126
| 102
| 80
| 59
| 42
| 29
| 19
| Б
| 15
| 24
| 36
| 53
| 74
| 98
| 120
| 141
| 158
| 171
| 181
|
Трис-буфер (рН 7,2 — 9,0).
Растворы:
А — 0,2 М трис (оксиметил)-аминометана (24,3 г соли в 1 л дистиллированной воды);
Б — 0,1N НСI.
Слить указанные количества растворов А и Б и долить до 100 мл дистиллированной водой (табл. 3).
Как исходные растворы, так и сами буферные смеси могут храниться длительное время. Однако во избежание ошибок (качество реактивов, неточность при составлении)
Таблица 3
| РН
| 7,2
| 7,4
| 7,6
| 7,8
| 8,0
| 8,5
| 9,0
| Раствор, мл
|
| Раствор А
| 25
| 25
| 25
| 25
| 25
| 25
| 25
| Раствор Б
| 43
| 40
| 35,7
| 30,6
| 25
| 12
| 5
| Вода дистиллированная
| 32
| 35
| 39,3
| 44,4
| 50
| 63
| 70
|
0,1 М ФОСФАТНЫЙ БУФЕР, pH 5,7—8,0
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР "
А) 0,2М раствора NaН2Р04*Н20 (27,58 г/1000мл)
Б) 0,2 М раствора Na2НР04 (28,38 г/1000 мл)
Х мл раствора А + Y мл раствора В + Дистиллированная вода до 200мл
рH
| А
| Б
| 5,7
| 93,5
| 6,5
| 5,8
| 92,0
| 8,0
| 5,9
| 90,0
| 10,0
| 6,0
| 87,7
| 12,3
| 6,1
| 85,0
| 15,0
| 6,2
| 81,5
| 18,5
| 6,3
| 77,5
| 22,5
| 6,4
| 73,5
| 26,5
| 6,5
| 68,5
| 31,5
| 6,6
| 62,5
| 37,5
| 6,7
| 56,5
| 43,5
| 6,8
| 51,0
| 49,0
| 6,9
| 45,0
| 55,0
| 7,0
| 39,0
| 61,0
| 7,1
| 33,0
| 67,0
| 7,2
| 28,0
| 72,0
| 7,3
| 23,0
| 77,0
| 7,4
| 19,0
| 81,0
| 7,5
| 16,0
| 84,0
| 7,6
| 13,0
| 87,0
| 7,7
| 10,5
| 90,5
| 7,8
| 8,5
| 91,5
| 7,9
| 7,0
| 93,0
| 8,0
| 5,3
| 94,7
| 7,9
| 7,0
| 93,0
| 8,0
| 5,3
| 94,7
|
Примечание.
Если требуется приготовить буферный раствор иной молярности, чем указано в настоящем руководстве, то следует изменить лишь молярность исходных растворов, количественные же их соотношения для получения рН остаются неизменными.
рН приготовленных буферных растворов перед употреблением следует проверять. Грубая проверка может быть осуществлена с помощью индикаторной бумаги, более точная — посредством специального прибора-потенциометра (рН-метр).
|
