Гистохимические методы: введение

Длительное время для изучения химического состава клеток и тканей пользовались исключительно классическими биохи­мическими методами, в основе которых лежит суммарное определение химических веществ в размельченной ткани (гомогенате). Однако, несмотря на свои положительные качества, эти методы не обеспечивали полного представле­ния о локализации тех или иных химических веществ в различных структурных компонентах клеток и тканей. Поиски методов, с помощью которых можно было бы определять локализацию химических веществ в целостных микроструктурах органов и тканей, привели к созданию гистохимического метода, объединяющего в себе гистологи­ческий и биохимический методы.

При гистохимических реакциях неорганические и органи­ческие вещества, входящие в состав клеток, вступают в химическую реакцию с различными реактивами (красителями) и образуют окрашенные продукты реакции. По степени интенсивности этих продуктов можно до некоторой степени судить и о количественном содержании химического веще­ства в той или иной структуре.

В основе большинства гистохимических реакций лежат общие принципы.

1. Определенные химические группировки окрашиваются тем или иным красителем. Например, фосфатные группы РНК образуют с основными красителями (пиронин, толуидиновый синий и др.) солеобразные окрашенные соединения

2. Краситель растворяется в определенном субстрате, входящем в состав клеточных структур. Например, окраска жировых включений  в  клетке   основана  на  растворении Судана в жировой капле.

3. Некоторые химические компоненты клеток, такие, как ДНК, полисахариды, неспособны реагировать с красителя­ми. В таких случаях прибегают к превращению их химиче­ских группировок в реакционно-активное состояние (гидро­лиз ДНК хлористоводородной кислотой, окисление полиса­харидов йодной кислотой). При этом освобождаются или создаются вновь   химические  группировки,  которые  спо­собны реагировать с соответствующими реактивами, в результате чего образуется окрашенный продукт реакции.

4. При выявлении локализации некоторых компонентов клетки  прибегают  к  многоступенчатым  промежуточным реакциям и переводу неокрашенного продукта реакции в окрашенный. Например, так поступают при гистохимиче­ском окрашивании ферментов (подробнее об этом см. ниже).

Новый метод получил широкое распространение в иссле­довательской практике. В настоящее время ни одна морфо­логическая лаборатория не обходится без применения гистохимических методик. Однако успешное владение ими требует усвоения определенных навыков и соблюдения ряда условий, так как в отличие от гистологических методик, носящих большей частью эмпирический характер, гистохимические основаны на определенных химических механизмах и обладают строгой специфичностью. Отсюда главное требование — особая точность и тщательность в работе. Критерием в оценке результатов гистохимической реакции является не только локализация химических веществ, но и интенсивность окраски исследуемых компонентов клеток и тканей, так как именно она свидетельствует о концентрации выявляемых веществ. Если при гистологической обработке материала возможны некоторые отклонения в ходе окраши­вания препарата, то приемы, используемые для подготовки материала и проведения гистохимических реакций, должны тщательно соблюдаться, ибо отклонения на любом этапе могут изменить ход реакции и в конечном итоге привести к неправильной оценке препарата.

Для создания надлежащих условий протекания химиче­ских реакций особое внимание нужно уделить приготовле­нию рабочих растворов, а также чистоте применяемой посуды и стекол, качеству реактивов и т. д.

В настоящее время  гистохимия  перешла  на  количественный уровень исследования с применением специальных приборов (цитоспектрофотометров), позволяющих доволь­но точно определять количественную характеристику интен­сивности окраски (продукта реакции), что особенно важно для оценки состояния метаболизма в исследуемых органах, тканях и отдельных клетках. Это еще в большей степени предъявляет повышенные требования к качеству проведения гистохимических реакций и соблюдению строгой стандарти­зации обработки сравниваемых объектов на всех этапах. Именно в этих целях в первую очередь применяют совмещение сравниваемых образцов в одном блоке с после­дующим получением срезов одинаковой толщины на одном стекле. Когда это сделать невозможно, необходи­мо в ходе резки располагать разные срезы на одном предметном стекле. При любом способе совмещения сравниваемые срезы следует подвергать всем этапам гисто­химических реакций одновременно, используя одни и те же порции реактивов.




Яндекс.Метрика