Унифицированный метод определение общего белка по биуретовой реакции
Принцип:
Белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди(2), при этом образуются соединения, окрашенный в фиолетовый цвет (биуретовая реакция).
Реактивы:
1. Натрия хлорид, ч.д.а или х.ч., 154 ммоль/л (изотонический раствор) 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют водой и доводят до метки водой.
2. Натр едкий, ч.д.а. или х.ч., 0,2 моль /л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.
3. Калия йодид ч.д.а. или х.ч., 30 ммоль/л раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра;0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором NaOH до метки и растворяют.
Реактив стабилен в течении 2 нед. при хранении в посуде из темного стекла.
4. Калий-натрий виннокислый 4-водный(сегнетова соль) ч.д.а.
5. Меди сульфат 5-водный ч.д.а или х.ч.
6. Биуретовый реактив: 4,5 сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла.
7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5 раствора йодида калия. Раствор стабилен.
8. Калибровочный раствор альбумина (из человеческой сыворотки):100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия.
Материал для исследования.
Сыворотка крови.
Ход определения.
Опытная проба: к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (и не позднее чем через 1 ч) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба: к 5 мл раствора биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора NaCI , далее обрабатывают как опытную пробу.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика:
Из калибровочного раствора готовят рабочие растворы как указано в (Таблице №1) Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива ; через 30-60 мин измеряют на фотометре, как в опыте против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график. Калибровочная кривая линейна до 100 г/л альбумина
НОРМАЛЬНЫЙ ВЕЛЕЧИНЫ: 65-85 г/л (6,5-8,5 г/100 мл)
Приготовление разведений для построения калибровочного графика
| №
пробирки
| Стандартный раствор, мл
| 0,9% раствор
Хлорида натрия
| Концентрация белка г/л
| 1
| 0,05
| 9,95
| 0,05
| 2
| 0,1
| 9,9
| 0,1
| 3
| 0,2
| 9,8
| 0,2
| 4
| 0,3
| 9,7
| 0,3
| 5
| 0,4
| 9,7
| 0,4
| 6
| 0,5
| 9,5
| 0,5
| 7
| 0,6
| 9,4
| 0,6
| 8
| 0,7
| 9,3
| 0,7
| 9
| 0,8
| 9,2
| 0,8
| 10
| 0,9
| 9,1
| 0,9
| 11
| 1,0
| 9,0
| 1,0
| 12
| 1,1
| 8,9
| 1,1
| 13
| 1,2
| 8,8
| 1,2
|
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА
в биологическом материале
Определение общего белка в сыворотке крови
по биуретовой реакции
Определение общего белка по биуретовой реакции является на сегодняшний день самым распространенным методом определения общего белка в сыворотке крови.
Метод относительно дешев, прост, обладает хорошей воспроизводимостью и специфичностью, использование его позволяет выполнять исследование как на анализаторах (автоматических и полуавтоматических), так и на обычном фотометре.
Принцип метода
Белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в фиолетовый цвет. По интенсивности окрашивания, которое пропорционально количеству белка, определяют содержание его в сыворотке крови.
Подготовка пациента
Для определения общего белка крови по биуретовой реакции кровь желательно брать утром натощак.
Реактивы
1. Натрия хлорид, ч. д. а. или х. ч., 154 ммоль/л (изотонический раствор): 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят до метки водой.
2. Натр едкий, ч. д. а. или х. ч., 0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.
3. Калия йодид, ч. д. а. или х. ч., 30 ммоль/л раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра: 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором едкого натра до метки и растворяют. Реактив стабилен в течение 2 недель при хранении в посуде из темного стекла.
4. Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль) ч. д. а.
5. Меди сульфат 5-водный ч. д. а. или х. ч.
6. Биуретовый реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла не более месяца.
7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5% раствора йодида калия. Реактив хранят в темном месте не более 2 недель.
8. Калибровочный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) - 100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия: 1 г альбумина из человеческой или бычьей сыворотки растворяют в 6 — 7 мл 0,9% раствора хлорида натрия и доводят изотоническим раствором хлорида натрия до объема 10 мл; 1 мл стандартного раствора содержит 0,1 г белка.
Материал для исследования
Для анализа могут использоваться как сыворотка, так и плазма. При этом обычно получают сравнимые результаты, хотя, из-за присутствия фибриногена, уровень общего белка в плазме на 2–4 г/л выше, чем в сыворотке.
Определение содержания белка в сыворотке, полученной в вакуумных системах с разделяющим гелем и без него, дает сопоставимые результаты. Не было получено существенных различий в содержании белка в образцах крови, собранных в стеклянных или пластмассовых вакуумных системах.
Для исследования не следует использовать гемолизированную сыворотку, так как гемоглобин также является белком и будет вступать в биуретовую реакцию, что приведет к ложному завышению результатов анализа: присутствие гемоглобина приводит к завышению результатов на 3 % на каждый 1 г/л свободного гемоглобина в сыворотке.
Нежелательно использовать хилезную сыворотку, так как она из-за мутности будет оптически интерферировать с результатами определения, а следовательно приведет к ложному завышению результатов. Для устранения интерференции, вызванной значительной липемией применяют экстракцию диэтиловым эфиром. При незначительном присутствии липидов можно провести исследование, установив "бланк" по пробе больного, либо развести пробу изотоническим раствором хлорида натрия, а затем умножить результат на степень разведения.
Интерферирующее действие оказывает и билирубин при концентрации более 85 мкмоль/л. Поэтому в случае гипербилирубинемии также используют либо разведение сыворотки, либо установку «бланка» по пробе больного.
В ряде случаев в реакцию могут вмешиваться препараты, применяющиеся для лечения, особенно у тяжелых больных. Так, например, декстраны, используемые в качестве плазмозамещающих растворов, образуют комплекс с медью и тартратом в реакционной смеси и приводят к образованию рыхлого синего осадка. Степень вмешательства зависит от концентрации декстрана и состава биуретового реактива. При вводимых обычно количествах декстрана величина ошибки может составлять от 3 до 50 %. Полагают, что добавление глицерина в реактив или использование низкой концентрации NaOH способны предотвратить вмешательства декстрана в ход реакции. Присутствие в образце ионов аммония может способствовать образованию комплексов аммония с ионами меди, приводить к снижению концентрации ионов меди в реакционной среде, и, соответственно, к снижению скорости реакции и ложноотрицательным результатам. В редких случаях вмешательство лекарственных препаратов, находящихся в сыворотке таково, что при взаимодействии биуретового реактива с сывороткой наблюдается либо развитие окраски, отличной от фиолетовой, либо появление мутности. Оценить количество белка в такой сыворотке невозможно.
Содержание общего белка устойчиво в сыворотке и плазме в течение 1 недели при комнатной температуре и, по крайней мере, 2 месяца при -20 °C.
Ход определения общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции
Опытная проба:
к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены.
Через 30 минут (и не позднее чем через час) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500 — 560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.
Холостая проба:
к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее обрабатывают как опытную пробу.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика:
из калибровочного раствора готовят рабочие растворы как указано ниже.
| № пробирки
| Калибровочный раствор альбумина, мл
| 154 ммоль/л раствор хлорида натрия, мл
| Концентрация альбумина, г/л
| 1
| 0,2
| 0,8
| 20
| 2
| 0,4
| 0,6
| 40
| 3
| 0,6
| 0,4
| 60
| 4
| 0,8
| 0,2
| 80
| 5
| 1
| -
| 100
|
Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива; через 30 — 60 минут измеряют на фотометре, как в опыте, против холостой пробы, начиная с наименьшей концентрации.
По полученным данным строят калибровочный график.
Калибровочная кривая линейна до 100 г/л альбумина
|
