ПОДГОТОВКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ
Кровь крысы (2-3 мл) собирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 0,5 ч при 37 °С. По истечении указанного времени тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, кровь центрифугируют (10 мин, 3000 об/ мин).
Полученную сыворотку сливают в чистую пробирку.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПЕЧЕНИ КРЫС
Реактивы:
1. Среда выделения: 25 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5 при 4°С), 1 ммоль/л раствор MgCl2, 5 ммоль/л раствор дитиотрейтола, 1 мг/мл сывороточного альбумина.
2. 0,9 % раствор NaCl.
Ход работы:
Животных декапитируют, печень быстро извлекают и промывают охлажденным 0,9 % раствором NaCl. Навеску ткани в 1 г измельчают ножницами и гомогенизируют 1 мин в 9 мл среды выделения, используя стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 300 g на рефрижераторной центрифуге. Надосадочную жидкость отбирают и центрифугируют 15 мин при 1500 g.
Всю работу по выделению плазматических мембран проводят на холоду.
ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
Реактивы:
1. Среда выделения: 0,1 моль/л КCl, 50 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5 при 4°С), 1 ммоль/л раствор MgCl2.
2. 2 % раствор сывороточного альбумина.
Ход работы:
Крысу декапитируют, мышцы задних конечностей быстро вырезают и помещают в стакан с охлажденной средой выделения. Через 5 мин мышцы переносят в чашку Петри, освобождают от жира, сухожилий и нервов, обсушивают фильтровальной бумагой и тщательно измельчают. К 1 г измельченной ткани добавляют 4 мл среды выделения и гомогенизируют смесь в течение 1 мин. Гомогенат центрифугируют 7 мин при 600 g (4 °С).
Осадок, содержащий обломки клеток, ядра и миофибриллы, отбрасывают. Надосадочную жидкость центрифугируют 5 мин при 2000 g для более полного удаления миофибрилл. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют 10 мин при 9000 g.
Поверхность полученного осадка митохондрий дважды ополаскивают 2 мл среды выделения для удаления верхнего рыхлого слоя, содержащего примесь саркоплазматического ретикулума. Внутренние стенки пробирки осторожно подсушивают фильтровальной бумагой. К осадку добавляют среду выделения из расчета 0,2 мл на 1 г ткани.
Осадок тщательно ресуспендируют микропипеткой.
ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ
Реактивы:
1. 0,9 % раствор КCl.
2. 0,3 моль/л раствор сахарозы, содержащий 0,01 моль/л раствор ЭДТА.
Ход работы: Крысу декапитируют, сердце быстро переносят в стакан с ледяным раствором КCl, хорошо промывают, окрашенный кровью раствор сливают. Отмытое сердце переносят на толстый слой фильтровальной бумаги, обсушивают и ножницами удаляют сосуды, соединительную ткань и жир. Желудочек вскрывают, из внутренней полости удаляют сгустки крови. Ткань еще раз прополаскивают ледяным раствором 0,9 % КCl и, обсушив фильтровальной бумагой, помещают в чашку Петри, поставленную на мелко наколотый лед.
Ножницами измельчают 5 г сердечной мышцы до кашицеобразного состояния. Измельченную ткань переносят в гомогенизатор и добавляют 0,3 моль/л раствор сахарозы, содержащий 0,01 моль/л раствор ЭДТА из расчета 10 мл раствора на 1 г сырой массы. Ткань гомогенизируют 1 мин
в стеклянном гомогенизаторе со стеклянным пестиком. Гомогенат центрифугируют при 600 g в течение 7 мин. Полученный супернатант центрифугируют 15 мин при 11000 g. Надосадочную жидкость сливают, плотный осадок митохонлрий осторожно растирают стеклянной палочкой в 2 мл раствора сахарозы с ЭДТА до гомогенного состояния. К полученной суспензии добавляют раствор сахарозы с ЭДТА до 40 мл и вновь осаждают митохондрии.
ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС
Реактивы:
1. 0,25 моль/л раствор сахарозы.
2. 0,25 моль/л раствор сахарозы, содержащий 0,01 моль/л раствор ЭДТА (среда выделения).
Ход работы:
Изолированную печень промывают в охлажденной среде выделения, измельчают ножницами в чашке Петри, стоящей во льду. В гомогенизатор переносят 1 г измельченной ткани, добавляют 9 мл охлажденной среды выделения и гомогенизируют в течение 1 мин.
Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин при 600 g для удаления обломков клеток и ядерной фракции. Полученный супернатант центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин. Осевшую
митохондриальную фракцию суспендируют в 0,25 моль/л растворе сахарозы, не содержащем ЭДТА, и вновь центрифугируют (14000 g, 10 мин). Cупернатант сливают, на полученный осадок митохондрий осторожно наслаивают 0,3 мл 0,25 моль/л раствора сахарозы. Легким движением смывают верхний рыхлый слой осадка. Процедуру повторяют еще дважды, и полученный плотный осадок митохондрий тщательно суспендируют с помощью пипетки в 0,5 мл 0,25 моль/л раствора сахарозы
| 
