Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (метод Севела, Товарек)
(Севела — Товарека).
Лактатдегидрогеназа — ЛДГ (L-лактат: NAD-оксидоредуктаза: К.Ф. 1.1.1.27) —гликолитический фермент, открытый Мейергофом в 1918 г., катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную.
Унифицированный метод по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (Севела — Товарека).
Принцип. L-Лактат под действием фермента сыворотки в присутствии NAD окисляется в пируват, который определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.
Реактивы.
1. Молочная кислота 80% ч.д.а., х.ч.
2. Натрия гидроокись ч.д.а., х.ч., растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.
3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5 мл 80 % молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.
4. Натрия фосфат пиро (Na4P2O7-10 Н2О) ч.д.а.
5. НС1 1 моль/л.
6.Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НО до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.
7. NAD окисленная форма. Готовят из расчета 3 мг NAD на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении в холодильнике.
8. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина:19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НС1 при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НС1 до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.
9. Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.
Ход определения.
Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1 : 2, смешивают с 0,3 мл раствора NAD, прогревают 5 мин при 37 "С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно прогретых при 37 °С, и инкубируют смесь при 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.
Расчет активности производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано в таблице. Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду.
Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с • л).
Нормальные величины: 220—1100 нмоль/(с • л), или 0,8—4,0мкмоль/(ч • мл) при 37 °С.
Воспроизводимость. Коэффициент вариации около 10 %.
Литература. Seuela M., Tovarek J. Cas. Lek Cesk., 1959, vol. 98, N 27, p. 844.
| 
