Практические советы Витальное окрашивание Прижизненное окрашивание Домашняя лаборатория Занимательная микроскопия Изготовление микропрепаратов Камера Горяева Классификация и маркировка объективов микроскопов Комбинации цветных стекол для выделения спектра Методы микроскопирования Методы исследования простейших Методы и приемы биологического эксперимента Микроскопия для начинающих Микроскопические измерения Модификации контрастной окраски по Граму Необходимое оборудование Общие методы заключения препаратов Организация и оснащение гистологической лаборатории Освещение по Келлеру Подготовка предметных стекол Поляризационная микроскопия Правила работы с микроскопом Правила ведения лабораторного журнала Приобретение микроскопа Приготовление микропрепаратов членистоногих Техника приготовления гистологических препаратов Фототубус для цифровых камер Формидрон инструкция по применению


 

Модификации контрастной окраски по Граму

в бактериоскопической и культуральной диагностике


Открытие, случайно сделанное более 100 лет назад датским физиком Кристианом Грамом, до настоящего времени остается одним из наиболее важных дифференциальных критериев в идентификации бактерий. Несмотря на относительную простоту постановки методики окраски, с одной стороны, и не совсем полную ясность ее механизма, с другой, окраска по Граму в подавляющем большинстве случаев достаточно четко дифференцирует две давно разделившиеся эволюционно ветви бактерий - грамположительные и грамотрицательные.


Вероятно, мало кому известно, что оригинальная окраска по Граму и общепринятая окраска по Граму - понятия неравнозначные. В том виде, в котором окраска была предложена первоначально, сейчас она практически нигде не используется. В оригинальной прописи комбинация красителей и этапы выглядят таким образом: в качестве основного красителя используется генциановый фиолетовый, протравы - йодный раствор, для обесцвечивания - абсолютный спирт, для дополнительной окраски - везувин, на всех этапах для промывания препаратов рекомендуется анилиновая вода [1].


В настоящее время <оригинальная> методика несколько упрощена и изменена. Оказалось, что не обязательно нужен для обесцвечивания препаратов абсолютный этанол, его вполне можно заменить 96% спиртом или ацетоном. Аналогично, нет необходимости в анилиновой воде, для этого сейчас обычно практикуют водопроводную. Вместо генцианового фиолетового и везувина стали почти повсеместно использовать кристаллический фиолетовый или метиленовый фиолетовый (основные красители) и нейтральный красный, реже фуксин (дополнительные красители). Единственное, что неизменно прочно занимает место в методике Грама, это йод, служащий надежной протравой. Его используют обычно в виде водных растворов с йодидом калия (раствор Люголя).


Примечание.

В отечественной литературе название <раствор Люголя> применяется к растворам йода любой концентрации в водных растворах йодида калия. В зарубежных источниках под наименованием <раствор Люголя> обозначают раствор, где сочетание йод - йодид калия - вода выступает в соотношении 1:2:100, а соотношение компонентов 1:2:300 именуется <раствор Грама> [3, 4]. В аптечной сети продается <раствор Люголя>, где сочетание компонентов 1:2:17.


Следует отметить, что для определения грампринадлежности бактерий предложены и модифицированные способы, причем число их неуклонно растет. Сейчас насчитывается по крайней мере несколько десятков модификаций, с помощью которых также можно определить отношение бактерий к окраске по Граму. Изменения в модификациях могут касаться комбинации различных основных и дополнительных красителей, использования разнообразных реактивов для протравливания и обесцвечивания, а также изменения количества этапов окраски за счет как их увеличения, так и совмещения [1].


Возможно, не все знают, что в качестве основного красителя помимо фиолетовых (кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый, генциановый фиолетовый) можно с успехом использовать, например, бриллиантовый зеленый. Он предложен, в частности, в модификации Г.П. Калины, при которой грамположительные бактерии приобретают зеленую окраску, а грамотрицательные - светло-розовую [1]. Получение сочетания цветов зеленый - красный более удачно в смысле контрастности, однако это не всегда удается. Например, такие дополнительные красители, как фуксин или нейтральный красный, особенно при длительной экспозиции, оказывают влияние на цвет основного (зеленого) красителя, что ведет к эволюции основной окраски от бирюзовой до фиолетовой. Грамположительные и грамотрицательные бактерии в этом случае утрачивают резкую контрастность. При малой же экспозиции получается очень бледная окраска, что затрудняет изучение грамотрицательных бактерий.


Во всех вариантах для основной окраски используется 0,5% раствор бриллиантового зеленого, для дополнительной - 0,25% раствор сафранина. Для приготовления 0,5% раствора бриллиантового зеленого берут 0,5 г красителя и растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воде, фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр. Допускается также использование коммерческого 1% спиртового раствора бриллиантового зеленого, который разводят наполовину дистиллированной водой. Фильтровать в этом случае не надо. 0,25% раствор сафранина делают так: вначале готовят исходный раствор, для чего 2,5 г красителя растворяют в 100 мл 96% спирта. Хранят в бутыли из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора смешивают 1 часть спиртового раствора и 9 частей дистиллированной воды.


Вариант 1 (<классический>).

На зафиксированный мазок из клинического материала (отделяемое уретры, шейки матки и др.) или из бактериальной культуры наносят на 1 мин 0,5% раствор бриллиантового зеленого. После промывания препарата водопроводной водой на мазок наносят водный раствор Люголя (1 г йода, 2 г йодида калия и 100 мл дистиллированной воды). Экспозиция 1 мин. После промывания приступают к обесцвечиванию препарата в 96% спирте. Последнее проводят под контролем глаза, погружая и вынимая препарат из стакана со спиртом. Обесцвечивание продолжают до тех пор, пока с тонких участков перестанут стекать зеленые струйки красителя. Препарат быстро вносят под струю водопроводной воды. Докрашивание проводят 0,25% раствором сафранина в течение 30 - 60 с. Препарат тщательно промывают и высушивают.

При правильной окраске в препаратах тонкие участки должны быть оранжево-красного цвета, толстые - зеленого. В мазке из клинического материала ядра лейкоцитов, эпителиальных клеток могут частично удерживать зеленую окраску, цитоплазма должна быть оранжево-розового цвета. Гонококки, расположенные на этом фоне, должны быть оранжево-красными, при этом обращают внимание и на другие морфологические признаки (парность, отсутствие цепочек, групп и др.). Грамположительная флора окрашивается в различные оттенки зеленого цвета. В правильно окрашенных мазках из культур гонококки выглядят в виде, как парных, так и отдельных кокков оранжево-красного цвета, собранных в скопления с более плотным центром и беспорядочной, рассеянной периферией, причем в центре колоний местами может сохраняться зеленая окраска. Интенсивность окраски может быть различной - от светло-алого до насыщенно-красного цвета. При наличии сочетанной грамположительной флоры (стафилококков, стрептококков и др.) последняя окрашивается в различные оттенки зеленого цвета (от изумрудно-зеленого до темно-зеленого).


Вариант 2.

Отличается от 1-го варианта тем, что вместо 96% спирта для обесцвечивания используют йодный спирт (0,1% йода и 0,5% йодида калия в 96% или абсолютном спирте). Для обесцвечивания на окрашенный и протравленный мазок наносят йодный спирт в количестве, необходимом для покрытия препарата. С помощью пинцета несколько раз покачивают стекло так, чтобы спиртовой раствор несколько раз переместился над мазком. Время обесцвечивания примерно 10 с. Докрашивание и промывание препарата, как и в 1-м варианте.

Использование йодного спирта в данной модификации уменьшает вероятность <переобесцвечивания> за счет дополнительного протравливания и является несколько экономичнее в смысле расхода спирта.

Приготовление йодного спирта: 0,5% г йодида калия растворяют в 100 мл 96% спирта. Процесс растворения ускоряется, если флакон подогреть на водяной бане. К полученному раствору добавляют 0,1 г кристаллического йода и тщательно перемешивают. Хранят в бутыли из темного стекла в закрытом месте. Можно йодный спирт приготовить и так: к 98 мл спирта, лучше абсолютного, добавить 2 мл 5% настойки йода (коммерческой) и 0,46 г йодида калия.


Вариант 3.

Основная окраска и протравливание, как в 1-м варианте. Для обесцвечивания берут йод-ацетон по прописи Preston - Morrell [1]. Экспозиция йод-ацетона, нанесенного на стекло, 10 с. Препарат промывают и докрашивают, как в 1-м варианте.

Йод-ацетон, по имеющимся наблюдениям, гораздо быстрее спирта обесцвечивает грамотрицательную флору и медленнее грамположительную, что практически устраняет возможность <переобесцвечивания> даже при более длительной экспозиции. Однако из-за токсичности паров ацетона данную модификацию рекомендуется осуществлять только в лабораториях, оборудованных вытяжными шкафами.

При окраске грамположительная флора приобретает травянисто-зеленый оттенок, грамотрицательная - оранжевый.

Для приготовления йод-ацетона готовят вначале реактив фортиса: 6 г йодида калия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 90 мл 96% спирта и после перемешивания - 10 г кристаллического йода. Хранят в бутыли из темного стекла. Йод-ацетон получают путем смешивания 3,5 мл реактива Фортиса и 96,5 мл ацетона. Хранят в темном месте.


Вариант 4 (<ускоренный>).

На чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и с помощью бактериологической петли вносят в нее немного суточной культуры бактерий. После перемешивания в мазок добавляют 1 - 2 петли 0,5% раствора бриллиантового зеленого и вновь тщательно перемешивают. Мазок оставляют до высыхания. Приготовленный препарат фиксируют жаром, пронося стекло несколько раз через пламя спиртовки. С помощью пипетки на препарат по каплям наносят йодный спирт (см. 2-й вариант) в количестве, необходимом для покрытия всей поверхности стекла. Стекло слегка покачивают пинцетом так, чтобы спиртовой раствор несколько раз переместился над мазком, после чего позеленевший реактив сливают. Препарат быстро вносят под струю водопроводной воды. Время воздействия йодного спирта примерно 10 с. Мазок из грамположительной флоры остается зеленым, из грамотрицательной светлеет вплоть до полного обесцвечивания. Докрашивают препарат, как в предыдущих вариантах.


Преимуществом варианта 4 является сокращение времени окрашивания за счет совмещения этапов: приготовление мазка совмешается с основным окрашиванием, а протравливание с обесцвечиванием. Достигается также экономия спирта, который, кстати, можно собирать после использования в отдельную посуду и использовать для горения спиртовки.


Во всех методиках, особенно в 4-м варианте, следует обратить внимание на недопустимость использования разбавленного этилового спирта, т.е. концентрации ниже 96%, иначе препараты будут <переобесцвечиваться>. Лучше накануне выдержать используемый спирт во флаконе с безводным сульфатом меди, что позволит убрать из спирта избыток воды.


В заключение обращаем еще раз внимание, что приведенные модифицированные способы окраски по Граму достаточно просты в постановке, не требуют дефицитных реактивов и специального оборудования и могут быть рекомендованы  для диагностики бактериальных инфекций.

Вестник дерматологии и венерологии, N 6-1998, стр. 26-28.





Литература

1. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. Под ред. К.И. Матвеева, М.И. Соколовой. М 1964;49 - 57.

2. Степанюк В.В. Окраска бактерий по Граму: современная оценка, причины грамвариабельной окраски. Микробиол журн 1990;52:5:97 - 106.

3. Baker F.J., Breach M.R. Medical microbiological techniques. London 1980;13,14,504,507.

4. Smith A., Bruton J. A color atlas of histological staining techniques. London 1978;129 - 130.


Яндекс.Метрика
Система Orphus