Методы микроскопирования

Фазово-контрастная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия. Предназначена для изучения живых, не окрашенных объектов. Метод фазового контраста основан на том, что фазовая скорость света обратно пропорциональна показателю преломления. Фаза луча, проходящего через объект с более высоким показателем преломления, чем у окружающей среды, будет запаздывать по сравнению с фазой того луча, который проходит только через среду. Глаз не способен воспринимать фазовые изменения света. Поэтому прозрачные, неконтрастные объекты при обычном микроскопическом исследовании остаются невидимыми. В фазово-контрастном микроскопе специальный конденсор и особо устроенный объектив регулируют изменения фазы световых волн и превращают разность фаз в разность интенсивностей света, благодаря чему детали строения объекта становятся доступными для глаза. Система колец в конденсоре и объективе отделяет те лучи, которые диафрагмировали (отклонились) на объекте от тех, которые не диафрагмировали. После того как диафрагмировавшие лучи проходят через фазовую пластинку объектива, вносящую дополнительный сдвиг по фазе, они рекомбинируются с недифрагировавшими лучами. Именно таким образом удается резко повысить контраст клеток или внутриклеточных структур.

В зависимости от размера фазовых колец и способа их получе­ния различают:

1. положительный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вно­сит «опережение» в прямо прошедший свет, при этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне ( КФ-4, КФ-4М );

2.отрицательный фазовый контраст (аноптральный или темнопольный), когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой плен­ки, что вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона (МФА-2).

	Эпителий слизистой оболочки полости рта фазовый контраст. объектив 20Х ахромат. Окуляр 10Х. Микроскоп БИОЛАМ Л-211 ЛОМО. Устройство  КФ-4ЛОМО

	Зигнема фазовый контраст. объектив 20Х стигмахромат. Окуляр 10Х. Микроскоп МИКМЕД 2 вар.2 ЛОМО  Устройство КФ-4М

Интерпретация фазово-контрастных изображений

Изображение в фазово-контрастном микроскопе создается в результате интерференции световых пучков, относительная фаза которых была изменена светособирающим устройством. Таким образом, изображение представляет собой карту разностей длин оптических путей между деталями препарата или между препаратом и фоном. Поскольку коэффициенты преломления белковых растворов зависят от их концентраций, то изображение в фазово-контрастном микроскопе представляет собой также и карту концентраций или масс белков и других компонентов протопласта.

Обратите внимание, что для достижения высокого контраста необходимо, чтобы дифрагированный свет был достаточно отделен от света нулевого порядка на всем оптическом пути, с тем чтобы первый не попал в фазовое кольцо в аднюю фокальную плоскость, объектива.

МИКРОСКОПИЯ В ТЕМНОМ ПОЛЕ

Исследование микроорганизмов в темном поле (темнопольная микроскопия) основано на явлениях рассеяния света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц. Микроскопия в темном поле зрения позволяет увидеть более мелкие частицы, чем в световом микроскопе. Она осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, снабженного специальными конденсорами (параболоид- конденсор ОИ-10 или кардиоид-конденсор ОИ-13) , который создает полый конус света. Вершина этого полого конуса совпадает с объектом. Лучи света, проходя через объект исследования в косом направлении, не попадают в объектив микроскопа. В него проникает только свет, рассеянный объектом.

При этом на темном фоне наблюдаются ярко светящиеся контуры микробных клеток и других частиц. Микроскопия в темном поле зрения позволяет определить форму микроба и его подвижность. Обычно темнопольная микроскопия используется при исследовании микроорганизмов, которые слабо поглощают свет и не видны в световом микроскопе, как, например, спирохеты.

Для создания темного поля можно также использовать обычный конденсор Аббе, поместив в центр его кружок черной бумаги. В этом случае свет устанавливают и центрируют по световому полю, а затем затемняют конденсор Аббе.

Препарат для микроскопии готовят по методу раздавленной капли. Толщина предметного стекла не должна превышать 1 —1,1 мм, иначе фокус конденсора придется в толщу стекла. Между конденсором и предметным стеклом помещают жидкость (дистиллированная вода) с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. При правильной установке освещения на темном поле видны яркие, светящиеся точки.

Другое ограничение метода темнопольной микроскопии состоит в том, что в поле зрения оказывается слишком много деталей, таких, как пузырьки воздуха или инородные частицы, которые ухудшают изображение.

Таким образом, данный метод лучше всего использовать для изучения мелких дискретных структур, достаточно удаленных друг от друга. 

Конденсор светлого и темного поля ОИ-10

Конденсор ОИ-10 предназначается создания в микроскопе светлого и темного поля при освещении объектов проходящим светом. Конденсор вставляется в гильзу осветительного столика микроскопа на место обычного конденсора.

Апертура конденсора светлого поля        0,6

Апертура конденсора темного поля        0,7

Конденсор темного поля ОИ-13

ТЕХНИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ И ИНСТРУКЦИЯ ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ

Конденсор темного поля ОИ-13 (кардиоид) предназначается для освещения объектов проходящим светом по методу темного поля при работе с микроскопами серии «Биолам». Апертура конденсора ... 1,2. Расстояние от последней поверхности фронтальной линзы конденсора до плоскости предмета (с учетом хода лучей в стекле и иммерсионной жидкости) ... от 1,25 до 1,4 мм.

Метод темного поля применяется для получения изображения прозрачных, непоглощающих и потому не видимых при наблюдении в светлом поле объектов. Пучок лучей, освещающих объект, выходит из конденсора в виде полого конуса и непосредственно в объектив не попадает. Изображение создается только светом, который рассеивается мелкоструктурными элементами объекта. В поле микроскопа на темном фоне видны светлые изображения мелких деталей; у крупных деталей видны только светлые края, которые рассеивают освещающие лучи.

Оптическую систему конденсора необходимо отцентрировать относительно объектива микроскопа так, чтобы при отсутствии препарата в выходном зрачке объектива не было заметно света.

Конденсор рассчитан на работу с предметным стеклом толщиной не более 1,2 мм. Конденсор состоит из сферического зеркала (рис. 1) и линзы-кардиоиды 2, склеенных между собой и вставленных в оправу 3 (рис. 2), ввернутую в цилиндр 4. Цилиндр укреплен на кольце внутри корпуса 5 конденсора.

Конденсор снабжен пружинящим упругим и двумя центрировочными винтами 6.

На каждом конденсоре награвированы его шифр, апертура (А =1,2), товарный знак предприятия-изготовителя и порядковый номер, две первые цифры которого означают две последние цифры года выпуска конденсора.

 ПОРЯДОК РАБОТЫ

1. Вставьте в тубус микроскопа окуляр, в револьвер микроскопа вверните объектив, выбранные для наблюдения.

2. Настройте освещение, руководствуясь техническими описаниями микроскопа и выбранного осветителя (рекомендуется применять осветители ОИ-19, ОИ-24, ОИ-31, ОИ-32, ОИ-36).

3. Установите на место обычного конденсора микроскопа конденсор темного поля и закрепите его стопорным винтом.

4. Нанесите на верхнюю линзу конденсора каплю иммерсионной жидкости.

5. Установите на предметный столик микроскопа препарат и закрепите его. Рекомендуется применять предметные стекла толщиной до 1,2 мм.

6. Поднимите конденсор так, чтобы иммерсионная жидкость соприкоснулась с предметным стеклом и распространилась по нему, после чего сфокусируйте микроскоп на объект, при этом в поле зрения должен наблюдаться эффект темного поля (ярко светящиеся частицы объекта на темном фоне).

7. Приведите с помощью винтов 6 центр зоны с темнопольным эффектом в центр поля микроскопа и приступите к наблюдению.

Помните, что получить хороший эффект темного поля можно только при правильной настройке освещения.

При работе с иммерсионными объективами необходимо снизить их апертуру до 0,8 в противном случае в объектив будет попадать не только свет, рассеянный частицами объекта, но и прямые лучи, создающие светлый фон, что значительно ухудшит контрастность изображения. Поэтому при наблюдении в темном поле с объективом 90X1,25 следует поместить в выходной зрачок объектива диафрагму, входящую в комплект конденсора.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Сущность люминесценции в том, что, поглощая различные виды энергии (световую, электрическую и др.), атомы некоторых веществ переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычной  обладает рядом преимуществ качественного и количественного характера:

*цветным свечением;

*высокой степенью контрастности светящихся объектов на темном фоне;

*возможностью исследования прозрачных и непрозрачных живых объектов, а также различных жизненных процессов в динамике их развития;

*возможностью обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител. Метод флуорохромирования почти не отличается от общеизвестных методов окрашивания анилиновыми красителями, хотя и требует меньше времени (доли минуты). В бактериологии он применяется как метод люминесцентного выявления возбудителя туберкулеза, для диагностики таких инфекционных форм, как дифтерия, гонорея, возвратный тиф и др. На люминесцентном микроскопе проводят фенотипический анализ клеток периферической крови, костного мозга и тканей на наличие поверхностных антигенов с помощью моноклональных антител (диагностика первичных и вторичных иммунодефицитов, лейкозов и т.д.), оценку функциональной активности фагоцитирующих клеток крови.

В современных микроскопах применяется новый метод флуоресцентной микроскопии — FISH, когда препараты маркируются для «многократной» флуоресценции. В этом случае различные структуры объекта светятся с разной длиной волны. Их можно рассматривать по отдельности с помощью соответствующих светоделительных пластин и запирающих фильтров. В микроскопах обеспечивается возможность одновременного наблюдения двух или трех маркировок в одном изображении.

Люминесценция наблюдается в виде флуоресценции или фосфоресценции.

Флуоресценция — свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу (от 10~9 до 10~7с) после его окончания.

Фосфоресценция — свечение, продолжающееся длительное время и по окончании процесса возбуждения.

Многие вещества живых организмов обладают собственной флуоресценцией (так называемой первичной или аутофлуоресценцией), однако интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и использующиеся для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы (флуоресцирующие красители). Такая наведенная флуоресценция называется вторичной. Флуорохромы очень широко используют в люминесцентной микроскопии для обработки биологических объектов, имеющих слабую первичную флуоресценцию.

Люминесцентное свечение подчиняется закону Стокса, согласно которому свет флуоресценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждения. Отдельные молекулы вещества обладают способностью на короткое время поглощать свет, а затем испускать его, но в другой длине волны, как правило, в сторону красного света (закон Стокса), превышая длину волны поглощаемого света возбуждения на 20-50 нм. Например, если объект поглощает синий свет, то светится зеленым, если зеленый — желтым, если желтый — красно-оранжевым.

Это позволяет отфильтровывать сравнительно слабую флуоресценцию от более ярких возбуждающих лучей.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии используют ближнюю ультрафиолетовую или синефиолетовую часть спектра. Люминесцентная микроскопия осуществляется с помощью специальных микроскопов. В настоящее время в лабораториях используют люминесцентные микроскопы: старые отечественные модели  МЛ-2, МЛ-3 и более современные люминесцентные микроскопы серии «Люмам» и  «Микмед 2 вар-11».

В люминесцентном микроскопе серии ЛЮМАМ  используют систему светофильтров для выделения сине-фиолетовой части спектра (ФС-1, СС-4, СС-8), теплозащитные фильтры для предохранения оптики от перегревания и выцветания препаратов (СЗС-14, СЗС-7, БС-8, кювет с водой или раствором медного купороса) и запирающий фильтр на окуляре для снятия возбуждающего света и пропускания света люминесценции (ЖС-18, ЖС-3).

Люминесцентный микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. Следует исключить вибрацию, которая создаст помехи, что особенно сказывается при микрофотографировании. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вредные газы от источника света. Лампа достигает полной силы света через 5-10 мин после включения, если сила тока при работе равна 4-5 А. Повторное включение лампы, возможно, только после ее охлаждения.

Большинство исследователей проводят люминесцентную микроскопию препаратов в падающем свете, поскольку он имеет ряд преимуществ перед освещением препарата снизу, а именно: наименьшая потеря света, идущего от источника света, лучший спектральный состав возбуждающего света, незначительное попадание прямого света в глаза исследователя и увеличение освещенности объектов.

При люминесцентной микроскопии используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло высокого качества. Иногда применяют его заменитель — диметилфталат, длительное использование которого может привести к порче объективов.