Приготовление препаратов для микроскопирования


	Практические советы Витальное окрашивание Прижизненное окрашивание Домашняя лаборатория Занимательная микроскопия Изготовление микропрепаратов Камера Горяева Классификация и маркировка объективов микроскопов Комбинации цветных стекол для выделения спектра Методы микроскопирования Методы исследования простейших Методы и приемы биологического эксперимента Микроскопия для начинающих Микроскопические измерения Модификации контрастной окраски по Граму Необходимое оборудование Общие методы заключения препаратов Организация и оснащение гистологической лаборатории Освещение по Келлеру Подготовка предметных стекол Поляризационная микроскопия Правила работы с микроскопом Правила ведения лабораторного журнала Приобретение микроскопа Приготовление микропрепаратов членистоногих Техника приготовления гистологических препаратов Фототубус для цифровых камер Формидрон инструкция по применению

Приготовление препаратов для микроскопирования

Препараты для микроскопирования готовят из крови, колоний бактерий, тканей животных и растений и др. В некоторых случаях приготовление препаратов несложно, в других — требует специальной техники.

Наиболее просто готовят так называемые нативные препараты, т. е. объекты в естественном их виде. В этом случае материал наносят на предметное стекло и покрывают тонким покровным стеклом. Иногда его смешивают с изотоническим раствором хлорида натрия или глицерином для разжижения, осветления и предохранения от высыхания.

Широко распространен метод окраски препаратов для микроскопирования. Способ окраски зависит от особенностей исследуемого материала и цели исследования.

Различные части препарата воспринимают краску по-разному, что делает их более четкими, позволяет отличить друг от друга отдельные структуры. Например, мазки крови окрашиваются азур-эозином для подсчета лейкоцитарной формулы, фуксином — для подсчета тромбоцитов, азуром II—для подсчета ретикулоцитов.

Для бактериоскопии — излучения под микроскопом микроорганизмов — существует большое количество методов окраски, в том числе и сложных — двумя и более красителями.

Существует негативный метод окраски, т. е. окрашивается фон препарата, на котором отчетливо видны неокрашенные микроорганизмы, например бледная трепонема.

Препарат для микроскопии не может быть толстым или плотным, так как свет должен хорошо проходить сквозь него, поэтому приготовление гистологических препаратов из тканей требует довольно сложной техники. Ткань обрабатывают спиртами, формалином или фиксирующими смесями, пропитывают целлоидином, парафином или желатином. Затем получают тончайшие срезы ткани при помощи специального прибора — микротома. После этого срезы окрашивают гематоксилин-эозином, Суданом, сложными смесями красителей, серебром и т. д. Срезы закрепляют на предметных стеклах смесью белка с глицерином. Для сохранения препаратов срезы заливают канадским бальзамом и покрывают покровным стеклом. Бальзам засыхает и гистологический препарат может храниться в течение многих лет.

Методика приготовления временных препаратов

Временные препараты так называются потому, что не сохраняются долго. После ознакомления с микрообъектом временный препарат смывается с предметного стекла. Приготовление микропрепарата - один из обязательных видов умений, формируемых в курсе биологии, начиная с 6 класса школьной программы.

Для изучения живых клеток микроорганизмов применяют препараты “раздавленная капля”, “висячая капля”, “отпечаток”, “агаровая пленка” (“микрокультура”). Препараты живых клеток рассматривают с “сухими системами ” микроскопа. Препараты, работа с которыми уже закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе.

Микропрепараты позволяют проводить широкий ряд опытов. Они предназначены для детального изучения микроскопических структур под микроскопом.

Способы приготовления временных микропрепаратов.

1. Возьмите предметное стекло и, держа его за боковые грани, положите на стол.

2. Положите в центр стекла объект исследования (тонкие волокна ваты).

3. В пипетку наберите немного воды из стаканчика и нанесите на препарат 1-2 капли.

4. Возьмите за боковые грани покровное стекло и положите его сверху на предметное стекло (рис.).

5. Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу

6. Препарат готов.

7. Разместите его на предметном столике микроскопа и рассмотрите его в начале при малом увеличение , а затем при большим.

Этапы приготовление микропрепарата.

Накрывание объекта покровным стеклом.

Препарат устьиц клеток растения.

Приготавливают несколько срезов нижней эпидермы листа и помещают их на 2 часа в 5 %-ный раствор глицерина. Срезы помещают на предметное стекло в том же растворе. Рассматривают препарат.

Затем заменяют глицерин на воду, оттягивая его из-под стекла фильтровальной бумагой. Смотрят, что изменилось.

После этого воду заменяют 20%-ным раствором глицерина или 1М раствором сахарозы. Наблюдают изменения

Молярная концентрация с – отношение количества вещества (в молях), содержащегося в растворе, к объему раствора. Единицы измерения - моль/м3, (моль /л). Раствор, имеющий концентрацию 1 моль/л, обозначают 1 М; 0,5 моль/л, обозначают 0,5 М.

Приготовление 1 М раствора САХАРОЗЫ.

Молярная концентрация C(B) показывает, сколько моль растворённого вещества содержится в 1 литре раствора.

C(B) = n(B) / V = m(B) / (M(B) · V),

где М(B) - молярная масса растворенного вещества г/моль.

Молярная концентрация измеряется в моль/л и обозначается "M". Например, 2 M NaOH - двухмолярный раствор гидроксида натрия. Один литр такого раствора содержит 2 моль вещества или 80 г (M(NaOH) = 40 г/моль).

Пример

Какую массу САХАРОЗЫ C12H22O11 нужно взять для приготовления 0,1 литра 1,0 М раствора?

Решение

M(C12H22O11) = C(C12H22O11) · V · M(C12H22O11) = 1 моль/л · 0,1 л · 342,29 г/моль » 34,229 г

Таким образом, для приготовления 0,1 литра 1 М раствора нужно взять 34,229 г и растворить в воде, а объём довести до 0,1 литра( довести до 100 мл).

Концентрацию раствора можно выразить количеством молей растворённого вещества в 1000 г растворителя. Такое выражение концентрации называют моляльностью раствора.

Препарат КЛЕТКИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧНИ ПОЛОСТИ РТА

Для работы нужны: микроскоп, предметное и покровное стекла, препаровальная игла, скальпель, пипетка, 0,9-процентный раствор NaCl (физиологический раствор), подкрашенный метиленовой синью или чернилами, спирт, вата.

Порядок работы

1.Тщательно протрите нетканной салфеткой предметное и покровное стекла.

2.При помощи пипетки нанесите на предметное стекло капельку подкрашенного метиленовым синим, физиологического раствора.

3.Протерев ручку скальпеля спиртом, проведите ею (не лезвием!) несколько раз по внутренней поверхности щеки или нижней губы. Вы снимете немного слизи вместе со слущившимися клетками слизистой оболочки полости рта.

4.Перенесите эту слизь в каплю на предметном стекле при помощи препаровальной иглы, осторожно смешайте слизь с подкрашенным раствором и накройте препарат покровным стеклом.

5.Поместите препарат под микроскоп и рассмотрите его. Найдите слегка окрасившиеся клетки. Рассмотрите в них бледно окрашенную цитоплазму и более темное ядро.

6.Зарисуйте рассмотренные вами клетки в тетради и сделайте надписи.

Методика приготовления постоянных микропрепаратов

Как понятно из заголовка отличие временного препарата, который может храниться относительно не долгий отрезок времени, постоянный препарат может храниться многие годы.

Существуют готовые наборы для изготовления постоянных препаратов, один из таких наборов изображен ниже.

Конечно, данный набор имеет свои ограничения для изготовления препаратов.

Обязательным условием для долгосрочного хранения препарата из растительного или животного материала является его фиксация. Фиксирующих жидкостей много, самые доступные из них: этиловый спирт и продающийся в аптеках препарат на основе формалина (Формидрон) Состав: 100 мл препарата содержат 10 г раствора формальдегида в пересчете на 37 % формальдегид; вспомогательные вещества: спирт этиловый 96 %, одеколон, вода очищенная.

Препарат ФОРМИДРОН, может быть использован для создания архива биологических объектов, вспомогательные вещества входящие в аптечный препарат, не сколько не мешают в сохранении объекта.

ВНИМАНИЕ ФОРМАЛЬДЕГИД ОБЛАДАЕТ РАЗДРАЖАЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ.

Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70-80 °С (в вытяжном шкафу! или на открытом воздухе), и использовать для фиксации.

Спирт-формол по Шафферу - 10% формалин, который готовят из 1 части 40% формалина и 2-3 частей 96 % спирта. Продолжительность фиксации 24-48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт. Выпадение белого осадка никак не сказываеться на свойстве фиксатора.

ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ

Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами.

Фиксация необходима с целью остановки (прекращения) жизнедеятельности клеток. Для этого объект помещают в соответствующий фиксатор на время от нескольких минут до нескольких часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА ПОД ПОКРОВНОЕ СТЕКЛО

Большинство используемых в цитологии и гистологии красителей представляет собой водные растворы. Чтобы сделать временный препарат, срез, вынув из водного раствора красителя, промывают и заключают в глицерин. Приготовить постоянный препарат несколько сложнее: необходимо покрыть срезы покровным стеклом, заключив их в прозрачную затвердевающую среду. Можно, ополоснув срезы дистиллированной водой, капнуть на них разогретый раствор желатины. Но большую сохранность и лучшее качество препаратов можно получить, заключив их в канадский бальзам (прозрачную смолу пихты с показателем преломления n= 1,535). Поскольку канадский бальзам не смешивается с водой, но растворим в ксилоле (толуоле, бензоле), создается необходимость провести препарат по «проводке» для срезов, но в направлении, противоположном тому, в которое стекла велись для удаления парафина и подготовке к окраске. При этом нужно помнить, что даже незначительное присутствие воды в срезе сделает препарат мутным, непригодным для изучения. Поэтому переносить срезы по проводке от воды к толуолу надо медленно, погружая стекло в стаканчик со спиртом или толуолом на 2—3 мин. Схема проведения срезов может быть следующей:

дистиллированная вода — ополоснуть,

спирт 70%-ный — 2 мин,

96%-ный — 2 мин,

100%-ный —3 мин,

Ксилол I — 2 мин,

Ксилол II — 3—5 мин.

Надо иметь в виду, что некоторые красители легко вымываются из препаратов как в воде, так и в спиртах. Поэтому в некоторых случаях приходится избегать промывки препаратов и проведения через спирты низких концентраций. Чтобы достигнуть обезвоживания, приходится препараты осторожно промокать фильтровальной бумагой, опуская их сразу в 96%- или 100%-ный спирт, можно заменять этиловые спирты ацетоном или изоамиловым спиртом.

Итак, задача, которая стоит при подготовке препарата для монтирования его под покровное стекло, состоит в том, чтобы, не вымыв красителя, добиться полного обезвоживания среза. Достигается это проводкой по спиртам возрастающей крепости, вплоть до 100%. Обработка срезов ксилолом имеет двоякое значение: с одной стороны, в нем достигается просветление препарата, усиливается его прозрачность (краситель при этом из препарата не вымывается), с другой стороны, создаются благоприятные условия для дальнейшего пропитывания среза канадским бальзамом, который растворим в ксилоле. Само заключение среза под покровное стекло осуществляется быстро, пока на препарате не испарился ксилол. Капля бальзама наносится на покровное стекло (оно должно быть чистым и сухим), и покровное стекло быстро перевертывается над срезом. Можно капать бальзам на предметное стекло на поверхность среза и быстро покрывать его покровным стеклом. Канадский бальзам должен иметь консистенцию растительного масла (или гуще). Через 1—2 дня бальзам застывает.

Вместо канадского бальзама можно использовать синтетическую среду на основе полистирола.

Для этого берут 25г бесцветного полистирола, 5 мл дибутилфталата (пластификатор может быть любой) и доливают ксилолом до 100 мл. Раствор должен иметь консистенцию меда. Заключение среза под покровное стекло не отличается, от выше описанного.

Несомненным плюсом синтетического бальзама это инертность и более лучшая сохранность красителей.

Этапы приготовления постоянного микропрепарата
1	Изучаемый объект помещают в раствор 1части ФОРМИДРОНА с 2 частями воды на несколько дней. Для мазков это время ограничивается 15 минутами и формидрон разводить не следует. В случае использования этилового спирта время фиксации составляет 15-20 мин.
2	После фиксации объект следует отмыть от фиксатора, для этого его помещают на несколько часов в проточную воду. Для удержания объекта при отмывке удобно поместить его в ситечко-шарик для заваривания чая. Исследуемый объект переносят в батарею спиртов с целью удаления воды. Мазки ополаскивают в проточной воде в течение 3-5 минут. Струя воды должна быть не сильной, мазок сушат.
3	Далее если необходимо препарат может быть окрашен одним из доступных вам красителей.
4	После окраски препарат готовят к заключению в монтирующую среду. Приготовить батарею ( ряд флаконов ) растворов спиртов возрастающей крепости для удаления воды. Возможно использовать как этиловый спирт (антисептический раствор) так и Изопропиловый спирт (ИПС) который можно приобрести в магазинах специализирующихся на продаже радиодеталей. Последовательно наливаем в лабораторные стаканчики этанол или изопропанол в концентрациях 50%, 70%, 96%, 99%. Объект помещают в стаканчик, начиная с 50% этанолом на 10 минут. Затем перемещают объект в стаканчики с все более высокой концентрацией спирта, выдерживая в каждом по 10 минут. В процессе такого перемещения этанол будет плавно вытягивать воду из объекта. Помещать объекты сразу в концентрированный этанол нельзя, так как в этом случае, быстро выходящая из клеток вода может повредить клеточные оболочки Для мазков столь долгое пребывание в спиртах не требуется , достаточно 30-60 секунд, так как некоторые красители могут вымываться из мазка.
5	Если Вы хотите заключить препарат в канадский бальзам, обезвоженный материал переносят в уайт-спирит или ксилол на 5-6 часов, Канадский бальзам можно заменить на раствор канифоли в уайт-спирите(ксилоле), по консистенции напоминающий сироп.
6	Если препарат заключается в глицерин-желатиновую смесь, то объект переносят не уайт-спирит, а в глицерин на несколько часов ( глицерин, аптечный) Заключение объекта в глицерин-желатин. Последний приготовляется следующим образом. Чистый желатин (7 г) размачивают в течение 2—3 ч в 42 см3 дистиллированной воды, добавляют 50 г глицерина и 0,5 г кристаллической карболовой кислоты. Все вместе нагревается при помешивании на водяной бане, фильтруется и охлаждается. При появлении осадка тщательно профильтровать через стекловату. Готовый «глицерин-желатин» хранить в герметичном сосуде. При комнатной температуре глицерин-желатин застывает. Небольшой кусочек глицерин-желатина иглой или скальпелем переносят на предметное стекло. Последнее слегка нагревают на пламени спиртовки, глицерин-желатин расплавляется. В него из глицерина переносится объект и покрывается покровным стеклом. Мазок заключают следующим образом, кусочек глицерин-желатина помещают на покровное стекло Последнее слегка нагревают на спиртовке, глицерин-желатин расплавляется, объект покрывается покровным стеклом. Пространство между предметным и покровным стеклом заполняется монтирующей средой, которая, закрепляет покровное и предметное стекла и консервирует объект. Самым главным требованием к монтирующей среде является соответствие ее коэффициента преломления света к аналогичному показателю стекла.
7	Заключение объекта в канифоль или канадский бальзам На покровное стекло по центру наносят каплю или, если стекло длинное, две капли жидкого раствора канифоли. Покровное стекло помещают каплей вниз и слегка прижимают Края покровного стекла не следует вытирать ватой или марлей, смоченной ксилолом, так как при этом часть смолы может растечься по чистой поверхности покровного стекла. Засыхая, она образует неровности, которые мешают наблюдению под микроскопом и от которых очень трудно избавиться. В результате неполного обезвоживания в окрашенных заключенных препаратах часто образуются непрозрачные или мутные зоны. Под микроскопом в таком участке среза и над ним обнаруживаются многочисленные мелкие капельки воды, окраска сильно выцветает. Чтобы избавиться от этого, снимают покровное стекло, смывают ксилолом синтетическую смолу или бальзам, обезвоживают срез в 100%-ном спирте, ацетоне или изопропиловом спирте, просветляют в смеси ксилола с обезвоживающим агентом и в 2-3 сменах свежего ксилола и вновь заключают. Синтетическая монтирующая среда на основе полистирола. Полистирол (бесцветный)-25г.(можно использовать пищевые стаканчики) Дибутилфталат-5мл (любой доступный пластификатор, если не добавлять, полистирол трескается после высыхания) Ксилол до 100 мл. Растворение происходит в течение нескольких дней, раствор должен иметь консистенцию меда.

Методика изготовления мазка-отпечатка.

Различают «сухие» и «влажные» мазки. Первые имеют ограниченное применение и используются почти исключительно при изучении крови и кровепаразитов. «Влажные» мазки применяются часто главным образом при изучении паразитических простейших, а также и в других случаях. Мазки изготовляются следующим образом. Пинцетом берут тот орган, из которого предполагается сделать мазок, и «намазывают» на покровное стекло. Мазок должен быть совершенно равномерным и одинаковой толщины на всем покровном стекле. Если этого достигнуть сразу не удалось, то при помощи препаровальной иглы можно частично исправить мазок.

Не давая подсохнуть мазку, покровное стекло опускают мазком вниз на теплый этиловый спирт, предварительно налитый в часовое стекло или солонку. Происходит быстрая коагуляция тканевых элементов, и мазок плотно пристает к стеклу. Дальнейшая обработка мазка та же, что и тотальных препаратов. После фиксатора следуют промывка в 70° спирте, вторичная промывка в спирте, перенос в воду, окраска, отмывка в воде; спирты возрастающей крепости, ксилол, бальзам (полистирол).

Методика изготовления мазка-отпечатка из печени рыбы:

1. рыбу декапитировать хирургическими ножницами;

2. вскрыть брюшную полость и поместить печень в чашку Петри;

3. печень рассечь лезвием и осторожно осушить поверхность разреза фильтровальной бумагой;

4. обезжиренное стекло слегка нагреть над пламенем спиртовки и коснуться поверхности разреза;

5. мазок высушить на воздухе и окрасить любым доступным красителем.

Мазки крови для исследования лейкоцитарной формулы готовят следующим образом.

	Шаг 1. Поместить небольшую каплю венозной крови на предметное стекло, с помощью стеклянной капиллярной пипетки, (или непосредственно из места укола пальца перенесите выступившую каплю крови на конец стерильного предметного стекла. Избегайте при этом всякого контакта между проколотым участком кожи и стеклом.) Оставляют стекло в горизонтальном положении.
	Шаг 2. Размазывают каплю крови по стеклу с помощью чистого шлифованного стекла, помещая его под углом 45°; коротким ребром, подождав, пока вся кровь расплывется по нему
	Шаг 3. Как только кровь растеклась по ребру, быстрым движением от капли проводят по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом травмируются форменные элементы крови.

	Шаг 4. После приготовления мазки быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска. Подсушить мазок можно, подержав его над абажуром лампы или помахав им в воздухе. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой». Густо-розовые и красноватые мазки непригодны для счета, так как они слишком толсты и клеточные элементы при этом дифференцировать невозможно.При медленном высыхании может изменяться морфология клеток.
Техника мазка - слева направо: Мазок 1 - Идеальный мазок Мазок 2 – В момент размазывания мазка произошла остановка. Мазок 3 – Перекос мазка. Мазок 4 - Капля крови слишком большая. Мазок 5 - Мазок слишком короткий.


Для приготовления мазка из гноя или мокроты используют два предметных стекла. Небольшое количество материала переносят стерильной петлей или иглой на середину предметного стекла и покрывают вторым так, чтобы осталась свободной треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два больших мазка одинаковой толщины.

Метод центрифугирования.

Объекты фиксируются в центрифужной пробирке. В ней же осуществляется и вся дальнейшая смена жидкостей вплоть до просветления. При этом перед каждой сменой жидкости производится центрифугирование. Из просветляющей жидкости со дна центрифужной пробирки объекты при помощи пипетки переносятся на предметное стекло в каплю бальзама. Метод центрифугирования применяется очень часто, например при изготовлении препаратов простейших.