Окраска по Граму в домашних условия

Модификации контрастной окраски по Граму  для домашнего использования

Открытие, случайно сделанное более 100 лет назад датским физиком Кристианом Грамом, до настоящего времени остается одним из наиболее важных дифференциальных критериев в идентификации бактерий. Несмотря на относительную простоту постановки методики окраски, с одной стороны, и не совсем полную ясность ее механизма, с другой, окраска по Граму в подавляющем большинстве случаев достаточно четко дифференцирует две давно разделившиеся эволюционно ветви бактерий - грамположительные и грамотрицательные.

В настоящее время <оригинальная> методика несколько упрощена и изменена. Оказалось, что не обязательно нужен для обесцвечивания препаратов абсолютный этанол, его вполне можно заменить 96% спиртом или ацетоном. Аналогично, нет необходимости в анилиновой воде, для этого сейчас обычно практикуют водопроводную. Вместо генцианового фиолетового и везувина стали почти повсеместно использовать кристаллический фиолетовый или метиленовый фиолетовый (основные красители) и нейтральный красный, реже фуксин (дополнительные красители). Единственное, что неизменно прочно занимает место в методике Грама, это йод, служащий надежной протравой. Его используют обычно в виде водных растворов с йодидом калия (раствор Люголя).

Примечание. В отечественной литературе название <раствор Люголя> применяется к растворам йода любой концентрации в водных растворах йодида калия. В зарубежных источниках под наименованием <раствор Люголя> обозначают раствор, где сочетание йод - йодид калия - вода выступает в соотношении 1:2:100, а соотношение компонентов 1:2:300 именуется <раствор Грама>. В аптечной сети продается <раствор Люголя>, где сочетание компонентов 1:2:17.

Возможно, не все знают, что в качестве основного красителя помимо фиолетовых (кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый, генциановый фиолетовый) можно с успехом использовать, например, бриллиантовый зеленый. Он предложен, в частности, в модификации Г.П. Калины, при которой грамположительные бактерии приобретают зеленую окраску, а грамотрицательные - светло-розовую [1]. Получение сочетания цветов зеленый - красный более удачно в смысле контрастности, однако это не всегда удается. Например, такие дополнительные красители, как фуксин или нейтральный красный, особенно при длительной экспозиции, оказывают влияние на цвет основного (зеленого) красителя, что ведет к эволюции основной окраски от бирюзовой до фиолетовой. Грамположительные и грамотрицательные бактерии в этом случае утрачивают резкую контрастность. При малой же экспозиции получается очень бледная окраска, что затрудняет изучение грамотрицательных бактерий.

Мы хотим привести ряд методик для определения грампринадлежности бактерий, при которых получается зеленая окраска грамположительной флоры и красная грамотрицательной. Эти модифицированные способы отработаны на большом лабораторном материале и их можно с успехом использовать при бактериоскопической и культуральной диагностике.

Во всех четырех вариантах для основной окраски используется 0,5% раствор бриллиантового зеленого, для дополнительной - 0,25% раствор сафранина. Для приготовления 0,5% раствора бриллиантового зеленого берут 0,5 г красителя и растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воде, фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр. Допускается также использование коммерческого 1% спиртового раствора бриллиантового зеленого, который разводят наполовину дистиллированной водой. Фильтровать в этом случае не надо. 0,25% раствор сафранина делают так: вначале готовят исходный раствор, для чего 2,5 г красителя растворяют в 100 мл 96% спирта. Хранят в бутыли из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора смешивают 1 часть спиртового раствора и 9 частей дистиллированной воды.

Вариант 1 (<классический>).

На зафиксированный мазок из исследуемого материала  или из бактериальной культуры наносят на 1 мин 0,5% раствор бриллиантового зеленого. После промывания препарата водопроводной водой на мазок наносят водный раствор Люголя (1 г йода, 2 г йодида калия и 100 мл дистиллированной воды). Экспозиция 1 мин. После промывания приступают к обесцвечиванию препарата в  ацетоне. Последнее проводят под контролем глаза, погружая и вынимая препарат из стакана с ацетоном. Обесцвечивание продолжают до тех пор, пока с тонких участков перестанут стекать зеленые струйки красителя. Препарат быстро вносят под струю водопроводной воды. Докрашивание проводят 0,25% раствором  фуксина в течение 30 - 60 с. Препарат тщательно промывают и высушивают.

При правильной окраске в препаратах тонкие участки должны быть оранжево-красного цвета, толстые - зеленого. В мазке из клинического материала ядра лейкоцитов, эпителиальных клеток могут частично удерживать зеленую окраску, цитоплазма должна быть оранжево-розового цвета. Гонококки, расположенные на этом фоне, должны быть оранжево-красными, при этом обращают внимание и на другие морфологические признаки (парность, отсутствие цепочек, групп и др.). Грамположительная флора окрашивается в различные оттенки зеленого цвета. В правильно окрашенных мазках из культур При наличии сочетанной грамположительной флоры (стафилококков, стрептококков и др.) последняя окрашивается в различные оттенки зеленого цвета (от изумрудно-зеленого до темно-зеленого).

Вариант 2. Отличается от 1-го варианта тем, что вместо 96% спирта для обесцвечивания используют йодный спирт (0,1% йода и 0,5% йодида калия в 96% или абсолютном спирте). Для обесцвечивания на окрашенный и протравленный мазок наносят йодный спирт в количестве, необходимом для покрытия препарата. С помощью пинцета несколько раз покачивают стекло так, чтобы спиртовой раствор несколько раз переместился над мазком. Время обесцвечивания примерно 10 с. Докрашивание и промывание препарата, как и в 1-м варианте.

Использование йодного спирта в данной модификации уменьшает вероятность <переобесцвечивания> за счет дополнительного протравливания и является несколько экономичнее в смысле расхода спирта.

Приготовление йодного спирта: 0,5% г йодида калия растворяют в 100 мл 96% спирта. Процесс растворения ускоряется, если флакон подогреть на водяной бане. К полученному раствору добавляют 0,1 г кристаллического йода и тщательно перемешивают. Хранят в бутыли из темного стекла в закрытом месте. Можно йодный спирт приготовить и так: к 98 мл спирта, лучше абсолютного, добавить 2 мл 5% настойки йода (коммерческой) и 0,46 г йодида калия.

Вариант 3.

Основная окраска и протравливание, как в 1-м варианте. Для обесцвечивания берут йод-ацетон по прописи Preston - Morrell [1]. Экспозиция йод-ацетона, нанесенного на стекло, 10 с. Препарат промывают и докрашивают, как в 1-м варианте.

Йод-ацетон, по имеющимся наблюдениям, гораздо быстрее спирта обесцвечивает грамотрицательную флору и медленнее грамположительную, что практически устраняет возможность <переобесцвечивания> даже при более длительной экспозиции. Однако из-за токсичности паров ацетона данную модификацию рекомендуется осуществлять только в лабораториях, оборудованных вытяжными шкафами.

При окраске грамположительная флора приобретает травянисто-зеленый оттенок, грамотрицательная - оранжевый.

Вариант 4 (<ускоренный>).

На чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и с помощью бактериологической петли вносят в нее немного суточной культуры бактерий. После перемешивания в мазок добавляют 1 - 2 петли 0,5% раствора бриллиантового зеленого и вновь тщательно перемешивают. Мазок оставляют до высыхания. Приготовленный препарат фиксируют жаром, пронося стекло несколько раз через пламя спиртовки. С помощью пипетки на препарат по каплям наносят йодный спирт (см. 2-й вариант) в количестве, необходимом для покрытия всей поверхности стекла. Стекло слегка покачивают пинцетом так, чтобы спиртовой раствор несколько раз переместился над мазком, после чего позеленевший реактив сливают. Препарат быстро вносят под струю водопроводной воды. Время воздействия йодного спирта примерно 10 с. Мазок из грамположительной флоры остается зеленым, из грамотрицательной светлеет вплоть до полного обесцвечивания. Докрашивают препарат, как в предыдущих вариантах.

Преимуществом варианта 4 является сокращение времени окрашивания за счет совмещения этапов: приготовление мазка совмещается с основным окрашиванием, а протравливание с обесцвечиванием. Достигается также экономия спирта, который, кстати, можно собирать после использования в отдельную посуду и использовать для горения спиртовки.

Во всех методиках, особенно в 4-м варианте, следует обратить внимание на недопустимость использования разбавленного этилового спирта, т.е. концентрации ниже 96%, иначе препараты будут <переобесцвечиваться>. Лучше накануне выдержать используемый спирт во флаконе с безводным сульфатом меди, что позволит убрать из спирта избыток воды.

В заключение обращаем еще раз внимание, что приведенные модифицированные способы окраски по Граму достаточно просты в постановке, не требуют дефицитных реактивов и специального оборудования и могут быть рекомендованы как диагностики для гонореи, так и других бактериальных инфекций.

Вестник дерматологии и венерологии, N 6-1998, стр. 26-28.

Литература

1. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. Под ред. К.И. Матвеева, М.И. Соколовой. М 1964;49 - 57.

2. Степанюк В.В. Окраска бактерий по Граму: современная оценка, причины грамвариабельной окраски. Микробиол журн 1990;52:5:97 - 106.

3. Baker F.J., Breach M.R. Medical microbiological techniques. London 1980;13,14,504,507.

4. Smith A., Bruton J. A color atlas of histological staining techniques. London 1978;129 - 130.

Культуральный мазок по Граму в модификации Калины

На обезжиренное стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора. В нем суспензируют культуру и туда же петлей вносят каплю спиртового раствора бриллиантовой зелени. После подсыхания препарат фиксируют над пламенем. Затем на препарат наливают основной краситель. Время экспозиции 1,5 - 2,0 мин. После этого краску сливают и стекло в наклонном положении промывают водой. Далее препарат в наклонном положении отмывают спиртом до отхождения облачков краски и немедленно промывают водой. Затем производят докрашивание препарата водным раствором фуксина в течение 2 мин, после этого окончательно промывают водой и просушивают. Культуральный мазок просматривают под иммерсией при большом увеличении: грамотрицательные бактерии выглядят ярко-розовыми, грамположительные - сине-черными.

2.6 Приготовление концентрированного раствора фосфатного буфера

В мерную колбу вместимостью 1000 см наливают 500 см дистиллированной воды, добавляют (34,00±0,01) г однозамещенного фосфорнокислого калия и тщательно перемешивают. Контролируют значение активной кислотности раствора и устанавливают требуемое значение рН, равное 7,2, раствором гидроокиси натрия массовой долей 20%. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (20±1) мин.

2.7 Приготовление разбавленного раствора фосфатного буфера

В мерную колбу вместимостью 1000 см помещают 1,25 см концентрированного раствора фосфатного буфера, добавляют небольшое количество дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор разливают по 10 см3 в пробирки, по 93 см3  в колбы вместимостью 100см3, стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (20±1) мин и используют для приготовления разведений.

Приготовление реактивов для окраски по Граму (модификация Г.П.Калины)

Приготовление реактива 1

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,50±0,01) г кристаллического фиолетового, добавляют небольшое количество этилового спирта и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят этиловым спиртом до метки.

Приготовление реактива 2

К 96 см3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм добавляют 2 см3 спиртового раствора основного фуксина массовой концентрацией 50 г/дм3 и 2 см3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/д3. Приготовление спиртового раствора йодистого калия проводят на водяной бане при температуре (45±5) °С при постоянном помешивании.

Приготовление раствора метиленового голубого для окраски препаратов

Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого

В коническую колбу вместимостью 150 см3 помещают (10,00±0,01) г метиленового голубого, приливают 100 см3 96%-ного этилового спирта, закрывают пробкой и тщательно перемешивают. Раствор ставят в термостат при температуре (37±1) °С на 24 ч, затем фильтруют через сухой складчатый фильтр в термостате при той же температуре.

Срок хранения основного раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37±1) °С - не более 3 мес.

Приготовление рабочего раствора метиленового голубого для окраски препаратов

К 30 см3 основного спиртового раствора метиленового голубого, приготовленного по (____), добавляют 100 см3 дистиллированной воды и 1 см3 раствора гидроокиси калия массовой концентрацией 10 г/дм3.

Методы микроскопических исследований

1 Сущность метода

Метод основан на визуальном наблюдении микроорганизмов с помощью приборов (микроскопов), позволяющих многократно увеличивать подготовленный исследуемый объект.

При микроскопическом исследовании учитываются как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом чувствительность метода - не менее 10*5 клеток в 1 см3 или 1 г исследуемого образца.

2 Подготовка к проведению анализа

2.1 Приготовление микропрепарата.

Для приготовления препарата жидкого продукта на чистое предметное стекло наносят петлей каплю продукта и распределяют на площади 1-2 см2.

Приготовленные микропрепараты высушивают при комнатной температуре на воздухе.

2.2 Фиксирование микропрепарата

Для закрепления клеток микроорганизмов на стекле высушенные микропрепараты фиксируют. Для этого предметное стекло с высушенным микропрепаратом, обращенным вверх, берут пинцетом и проводят 3-5 раз через верхнюю часть пламени горелки с промежутками в 5-6 с. Зафиксированный микропрепарат охлаждают на воздухе.

2.3 Окрашивание микропрепарата метиленовым голубым

Зафиксированный микропрепарат помещают на подставку для окраски мазком вверх. Пипеткой наносят рабочий раствор метиленового голубого по 6.2.13.2 так, чтобы покрыть весь мазок, по истечении 30-60 с краситель осторожно сливают. Препарат промывают водой.

Окрашенный мазок высушивают на воздухе.

8.7.2.4 Окрашивание микропрепарата по Граму

Зафиксированный микропрепарат помещают на подставку для окраски мазком вверх, накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор кристаллического фиолетового по 6.2.11.2. Окраску проводят в течение 1-2 мин.

Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя по 6.2.11.3 на 1-2 мин до почернения препарата.

Раствор Люголя сливают. Предметное стекло погружают несколько раз в этиловый спирт. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.

Микропрепарат тщательно промывают водой.

Повторную окраску микропрепарата проводят водно-спиртовым раствором фуксина по 6.2.11.5 в течение 2 мин.

Подготовка микропрепаратов и окраска по Граму в модификации Г.П.Калины

На предметное стекло в каплю воды с внесенной агаровой культурой вносят петлей каплю реактива 1, приготовленного по 6.2.12.1. Смесь распределяют на площади 1-2 см2, просушивают при (20±2) °С и фиксируют по(____). Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2, приготовленный по 6.2.12.2, чтобы жидкость покрывала всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания - 30-60 с. После окрашивания препарат ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой.

Грамположительные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - красный цвет.